大肠杆菌的检测(MPN计数法)

食品微生物检验技术课程综述大肠杆菌的检测（MPN计数法）院系：食品科学与药学学院班级：食科114姓名：张花学号：114031431组长：张军玲成员：张花赵晶郁朱娟娟2大肠杆菌Petrifilm测试片计数法摘要食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。关键词大肠杆菌Petrifilm测试法31设备和材料1.1恒温培养箱：36±1℃。1.2冰箱2~5℃。1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。1.4天平：感量0.1g。1.5均质器1.6振荡器。1.7无菌吸管：lmL(具0.01mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。1.8无菌锥形瓶：容量500mL。1.9玻璃珠:直径约5mm。1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸1.11试管架。2.培养基和试剂2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。2.2EC肉汤。2.3蛋白胨水。2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。2.5磷酸盐缓冲液。2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。42.71mol/L氢氧化钠（NaOH)：称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。2.81mol/L盐酸（HCI)：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。3检验程序4.样品稀释4.1固体和半固体样品：以无菌操作将检样25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内或其他稀释液的灭菌锥形瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8000-10000r/min的速度处理1～2min,做成1:10的样品均匀稀释液）。4.2液体样品：以无菌吸管吸取样品25ml置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制5成1：10的样品匀液。4.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH)或1mol/L盐酸（HCI)调节。4.4用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,沿管壁缓缓注入含有9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。4.5根据对样品污染状况的估计,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全程不得超过15min。5检验5.1接种和培养选取2~3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面上，揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1ml垂直地价在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，将压板放置在上层膜中央处，轻轻地压下，是样品匀液覆盖与圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1min意识培养基凝固。将测试片的透明面朝上放于36℃的培养箱内，地跌层数不超过20片，肉、家禽和水产品，培养时间为24±2h；其他食品培养时间为48±2h。5.1判读可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、Petrifilm自动判读仪计数。蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分6蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区成蓝色时，需要进一步稀释样品匀液，重新检验。6大肠杆菌测试片技术的报告选择菌落数在15~150之间的稀释度，两张测试片菌落平均乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g(CFU/ml)表示。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度测试片上均无菌落生长，以“小于1乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150，计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。技术菌落数大于150个的测试片，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数以后乘以20，即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20c㎡）。7参考文献〖1〗中华人民共和国国家标准GB/T-4789.38-2010。〖2〗食品微生物检验/周建新主编。北京化工工业出版社，2011.6