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大豆萌发过程中护肤活性成分变化的研究及萌芽护肤霜的合成贾小凡李灏一张琪（北京化工大学理学院实验1001北京102200）摘要：测定大豆萌发过程中具有护肤功效的异黄酮等质量分数的变化。结果表明，萌发能显著提高大豆中活性成分的质量分数，萌发72h时，总异黄酮的质量分数均达到较高水平，比未发芽大豆的质量分数增加了40%。得出结论为利用大豆萌发过程可以有效提高自身生物学效应，并为发芽大豆在化妆品及护肤品中的应用提供理论基础。在此理论基础之上，经过多次试验，最终确定护肤品配方并将其合成。关键词：护肤；大豆异黄酮；活性成分;多相混合1、前言大豆是一种营养价值极高的植物，现在已经广泛用于食品、医药、保健等诸多领域。豆芽的优点是除富含蛋白质、不饱和脂肪酸外，还有其他许多生物活性成分，如大豆异黄酮、大豆皂苷、维生素等。谷物、豆类等经适当的发芽处理后，不仅其化学成分均有所改变，营养价值得以提高，而且还增加了一些药效成分。大豆中的活性成分主要有大豆异黄酮、大豆皂苷、大豆多糖及还原性多糖、各种维生素等，这些活性成分均具有一定的护肤功效。作者研究了大豆萌发过程中具有护肤活性的大豆异黄酮含量的变化，以期为发芽大豆在化妆品方面的深度开发及利用提供依据。作者研究的课题便是基于上述的理论基础，旨在开发出一种纯天然的豆芽护肤品。2、实验部分实验部分在北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室完成。2.1、发芽大豆的培养500g大豆，洗净后置于250mL烧杯中，加入大豆质量2倍的水，于室温下浸泡12h，从烧杯中取出后沥干，将泡好的大豆置于垫有湿润脱脂棉的培养皿中，并用湿润的纱布覆盖，置于22℃左右温度下培养萌发。分成若干小组，分别培养24h、48h、72h、96h……2.2、发芽大豆提取液的制备2.2.1、实验仪器与试剂仪器：超声波震荡仪，榨汁机，旋转蒸发器，超速冷冻离心机，减压抽滤装置，电子天平，试管、烧杯、离心管、量筒等若干。试剂：75%乙醇溶液，去离子水，1,3-丙二醇。2.2.2、实验过程（1）利用电子天平称取133.10g发芽24h的豆芽，放入榨汁机中榨汁，量取200ml75%乙醇溶液倒入榨汁机，将榨出来的豆芽汁倒入500ml烧杯，另取150ml75%乙醇溶液洗涤榨汁机。可得400ml的大豆待提取液。（2）将盛放提取液的烧杯用保鲜膜封好，并于顶部戳若干小孔。将其放入超声振荡仪并将水温保持在50-60℃超声工作35min。（3）将上一步所得混合液放入离心管，配平每个离心管中的液体（用电子天平称），使用超速冷冻离心机离心20min，转速6000r/s。（4）离心后，将上清液倒入锥形瓶中，上清液中含有少量不溶物，用减压抽滤装置进行抽滤，得澄清溶液。（5）将澄清溶液放入旋转蒸发仪中，减压蒸发乙醇。（6）将20ml1,3-丙二醇加入剩余液体中，充分摇匀，再加40ml1,3-丙二醇使上层出现油状物，最后再加40ml1,3-丙二醇溶液，出现大量气泡（皂苷所致）。（7）将上一步所得溶液放入超声振荡仪中，气泡明显减少，得发芽大豆提取液。（8）按同样的方法分别处理48h，72h，96h等剩余发芽大豆。2.3、发芽大豆总异黄酮含量的测定2.3.1、实验试剂与仪器仪器:安捷伦1100高效液相色谱仪；T6新世纪紫外分光光度计；超声波振荡仪；恒温培养箱。试剂：大豆种子铁丰29；染料木素、大豆苷元、染料木苷、大豆苷、黄豆黄苷、齐墩果酸，均为色谱纯；香草醛、乙醇、高氯酸，甲醇、磷酸、硫酸等，均为分析纯。标准曲线的制作：准确称取4.135mg染料木素纯品于100mL容量瓶中，加质量分数75%乙醇（下同）溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2mL分别于10mL容量瓶中，用75%乙醇稀释至刻度。测定240nm,260nm和280nm处吸光度值A240,A260,A280，按A=A260-(A240+A280)/2计算A，并对A和浓度的关系进行回归分析，绘制标准曲线。样品的测定：取一定量体积的提取液，在240nm，260nm，280nm处测定吸光度，根据标准曲线回归方程，计算发芽大豆总异黄酮的含量。2.4发芽大豆异黄酮组分含量的测定色谱条件：色谱柱为Nova-pakC183.9×150mm4μm；流动相为A标准曲线的制备：准确称取大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素各5mg，分别放于5个100mL容量瓶内，甲醇定容，然后按照一定比例进行梯度稀释，取样用高效液相色谱仪进行定量分析。以溶液浓度为自变量x，峰面积为因变量y，进行回归分析，绘制标准曲线。异黄酮组分的测定：取“样品的测定”中所述发芽大豆提取液，用0.45μm微孔过滤器过滤到液相色谱专用小瓶中，进行高效液相色谱分析，根据峰面积和相应的标准曲线取出5种异黄酮组分的含量。2.5结果与讨论2.5.1大豆异黄酮标准曲线的绘制2.5.2大豆异总黄酮标准曲线的绘制大豆异黄酮的最大吸收波长在260nm处，采用三波长紫外分光光度法测得A(A=A260-(A240+A280)/2)为纵坐标，大豆异黄酮质量浓度为横坐标绘得标准曲线，见图1。通过分析，得回归方程为y=0.0719x+0.0073,R2=0.9995，标准曲线具有显著相关性。图1大豆异黄酮标准曲线2.5.3大豆异黄酮组分回归方程准确吸取标准液5μl进样，以溶液浓度为自变量x，峰面积为因变量y，进行回归分析得出5种标准液的峰面积(y)与浓度(x)均线性相关且相关系数显著，结果如表1所示。表1大豆异黄酮组分回归方程Tab.1RegressionequationforfivecomponentsofIsoflavones异黄酮回归方程相关系数大豆苷Y=20.678x+3.5714R2=0.9992黄豆黄苷Y=16.302x-4.3079R2=0.9991染料木苷Y=26.867x+9.6332R2=0.9996大豆苷元Y=26.437x+5.3944R2=0.9997燃料木素Y=45.922x+11.0130R2=0.99972.5.4大豆萌发期间异黄酮含量的变化目前发现的大豆异黄酮共有12种，分为游离型的苷元和结合型的糖苷两大类。其中苷元约占大豆异黄酮总量的2%～3%，包括染料木素、大豆苷元和黄豆苷元。糖苷约占总量的97%～98%，主要以染料木苷、大豆苷、黄豆黄苷、6″-O-丙二酰基染料木苷和6″-O-丙二酰基大豆苷等形式存在。由于后两种糖苷在加热、光照等条件下易脱去丙二酰基而转变为普通糖苷[21]，因此作者研究的重点为染料木苷和大豆苷及其苷元形式。表2数据表明，随着发芽时间的延长，发芽大豆总异黄酮质量分数不断增加，在发芽第72h时，总异黄酮的质量分数达到较高水平较未发芽大豆相比提高了40%以上。尤其是游离型的大豆苷元和染料木素的质量分数分别提高了约252%和118%。大豆发芽72h以后总异黄酮及各成分质量分数逐渐下降。表2大豆萌发不同阶段总异黄酮质量分数及其5种成分的测定结果Tab.2TotalSoybeanIsoflavonescontentandcompositionofdifferentstagesofgerminationt/h平均芽长/cmw（总异黄酮）/%w（异黄酮）/%大豆苷黄豆黄苷染料木苷大豆苷元染料木素000.121.91×10-22.02×10-31.83×10-28.40×10-46.80×10-41200.131.82×10-22.65×10-31.77×10-29.10×10-47.50×10-4240.30.151.87×10-22.74×10-31.95×10-21.24×10-38.40×10-4481.50.162.18×10-23.26×10-32.40×10-21.82×10-31.04×10-3722.40.172.29×10-22.50×10-32.40×10-22.96×10-31.48×10-3963.70.152.09×10-21.86×10-32.24×10-21.94×10-31.10×10-31204.50.142.06×10-22.30×10-32.29×10-21.50×10-37.20×10-4大豆异黄酮是大豆中最主要的护肤活性成分，具有雌激素样作用、抗氧化活性及调节皮肤脂肪代谢等多种药理作用，可以广泛应用于延缓衰老系列化妆品中。近年来的研究表明异黄酮苷元比异黄酮葡萄苷更容易被人体吸收，抗氧化等能力也较大。比较了大豆异黄酮不同组分的抗氧化性能，其抗氧化能力为染料木素大豆苷元大豆苷染料木苷；对大豆异黄酮几种单体成分的雌激素活性进行了比较，其雌激素样作用为染料木素大豆苷元染料木苷大豆苷。因此可以得出异黄酮苷元比其葡萄糖苷成分具有更高的生物利用率，提高苷元的含量更具有生物学价值。豆类种子在发芽过程中β-葡萄糖酶被激活，是将异黄酮葡萄糖苷上的糖苷去除形成苷元的主要原因。2.6、合成萌芽护肤霜2.6.1、实验仪器与试剂仪器：电子天平，乳化匀质机，电热炉，烧杯、玻璃棒等若干试剂：A（油相）：olivem2.5g,PES1.0g,混醇1.0g，FDC-HDG362.0g，DM1002.0g，IPM5.0g，STS5.0g，GTEH5.0g共计23.5g。B（水相）：卡波9400.2g，EDTA0.02g，汉生胶0.1g，甘油4.0g，1,4-丁二醇3.0g，海藻糖2.0g共9.32g。C（配料）：10%烧碱溶液0.3g，K1450.12g，发芽3天的大豆提取液1.0g，香料0.05g。2.6.2、合成过程（1）将油相试剂用电子天平称好在烧杯中混合均匀，加热至80℃。(2)同时将水相试剂用电子天平称好在烧杯中混合均匀，加适量去离子水，用乳化匀质机搅拌使试剂充分溶解，加热至80℃，与油相混合，加去离子水至100g，用乳化匀质机搅拌5min。(3)加入配料，搅拌均匀，静置使其凝固。得萌芽护肤霜。2.7、人体测试2.7.1、皮肤纹理度的测试：2.7.1.1、实验仪器多功能皮肤图像分析系统图22.7.1.2、实验样品：样品1：含有6%萌芽大豆提取物的护肤霜；样品2：含有6%大豆提取物的护肤霜；样品3：不含植物功效成分的组方。2.7.1.3、测试方法：图32.7.1.4、测试结果：皮肤平均粗糙度：标记区域按时涂样数据分析定期检测测初始值志愿者图4：样品使用后皮肤平均粗糙度相对降低率变化情况第四周时各测试样品区域的皮肤粗糙度相对降低效果分别为：萌芽护肤霜＞大豆护肤霜＞空白对照。2.7.2皮肤色度的测试：2.7.2.1实验仪器：分光测色仪CM-2600d图52.7.2.2实验样品：样品1：含有6%萌芽大豆提取物的护肤霜；样品2：含有6%大豆提取物的护肤霜；样品3：不含植物功效成分的组方。2.7.2.3测试方法：图62.5.2.4测试结果：(1)皮肤色度L值表征皮肤的亮度，L值越大表示皮肤的亮度越大，皮肤越有光泽。标记区域按时涂样数据分析定期检测测初始值志愿者图7：样品使用后皮肤色度L值变化情况样品对皮肤亮度的提高效果：萌芽护肤霜＞大豆护肤霜＞空白对照。(2)皮肤色度B值表征皮肤的黄度，B值越大表示皮肤的色泽越黄，肤色越暗哑。图8：样品1、2、空白使用后皮肤色度B值变化情况样品对皮肤暗黄的去除效果：萌芽护肤霜＞大豆护肤霜＞空白对照。2.7.3结论：根据人体皮肤纹理度和皮肤色度测试结果可得：萌芽护肤霜具有较好的延缓衰老抗皱祛皱功效和美白靓肤的功效。3、结论与展望通过大豆萌发过程的研究表明，大豆异黄酮、大豆皂苷、还原性多糖、多种维生素的质量分数均随萌发时间的延长而提高，且在发芽72h达到较高水平，尤其是苷元形式的异黄酮质量分数得到有效提高。萌芽护肤霜的护肤功效实验结果表明，发芽大豆提取液具有良好的抗氧化清除自由基功效，可以改善皮肤纹理度，延缓皮肤衰老，因此，发芽大豆提取物可以作为功效成分添加剂应用于化妆品中。希望发芽大豆可以被更多的应用于化妆品的生产过程中，成为实用有效的化妆品添加剂。参考文献[1]郭鸰,霍贵成.发芽大豆生化特性及其营养变化[J].粮油食品科技,2002,10(4):8-1