大豆蛋白的提取及与含量测定

大豆蛋白的提取及与含量测定在此处键入欢迎信息，长短均可。最好包括本站点的内容简介。一、目的要求1.学习掌握离心机、752N、天平的使用方法和注意事项；2.学习掌握大豆蛋白的提取及制备丙酮干粉的原理和方法；3.学习计算蛋白质收率,测定蛋白质含量二、实验原理（一）1.大豆蛋白的等电点为4.5-5.0是酸性蛋白，尽管大豆中含有水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白和醇溶蛋白，但其主要成分为碱溶蛋白，本实验为节省丙酮用量只进行碱提；2.丙酮（有机溶剂）可降低溶液的介电常数、破坏蛋白质的水化膜，故可使蛋白质在一定条件下沉淀析出；调节蛋白质溶液的pH值到等电点附近，有利于蛋白质的沉淀。三、试剂、材料及仪器1.0.2%的NaOH；2.6mol/L的HCl；3.1mol/L的HCl4.化学纯级丙酮5.市售大豆粉6.精密pH试纸7.天平8.离心机（普通）9.离心内、外套管10.烧杯11.搅拌棒四、实验步骤提取：.称取3克大豆粉，用0.2%NaOH30毫升。（先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌）NaOH溶液），室温下搅拌抽提15min，于6000r/min离心7min,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物，再经过滤；留出上清液2毫升稀释50、100倍做含量测定三、实验步骤制干粉：量上清液的体积，加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，先用6mol/L的HCl调pH至6.0，再用1mol/L的HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min，(留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，加入丙酮目的使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉（上清液回收），用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束后，再称重并计算产率。Folin酚法测定蛋白质含量目的要求掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。试剂和器材1、材料：本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。2、试剂：（1）0.03mol/LPH7.8的磷酸缓冲液。（2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。（3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10gNaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3；称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月。(4)、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并中保存，可使用多年。上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。3、器材：试管10支试管架一个移液管：（5ml、1ml）移液管架洗瓶恒温水浴752N型分光光度计操作方法标准曲线的制作：标准酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸缓冲液溶解的酪蛋白，浓度为200μg/ml。用一支0.5ml移液管分别取上述标准酪蛋溶液0ml,0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml各加到一支试管中去，将此吸管用0.03mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影响）取上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至1ml。再在另一支试管中加入1ml缓冲液作空白对照。于上述试管中各加入1mlFolin试剂甲并不时地进行振荡，10min后再加入后1in试剂乙的应用液4毫升。立既摇匀放入55℃水溶中保湿5min。取出后用自来水冷却1min。于波长650nm进行比色测定各管的OD值，以蛋白质的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，既可得到标准曲线。Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取7支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定试管号1234567蛋白质标准液（ml）（mg)000.10.020.20.040.40.080.60.120.80.161.00.2PH7.8的buffer（ml）10.90.80.60.40.20Folin-甲试剂（ml）1111111于室温下不停地振荡10minFolin-乙应用液（ml）4444444立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650A650值`2、样品测定：取两支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲线（可取两支试管编号8、9，与工作曲线同时进行反应和比色测定）；试管号89蛋白质稀释液（ml）（mg)11PH7.8的buffer（ml）00Folin-甲试剂（ml）11于室温下不停地振荡10minFolin-乙应用液（ml）44立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650A650值蛋白质浓度的计算：A650值对应的mg数(Pr)Pr(mg/ml)=×稀释倍数Pr溶液的ml数思考题1、采用Folin的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？2、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。五、注意事项（一）使用离心机的方法及注意事项：离心机的工作原理是：在离心力场的作用下，可加速悬浮液中固体颗粒沉降或漂浮的速度，从而将不同的物质分离；离心机是生化实验中经常用于提取、分离、纯化的常用设备，其操作中的关键环节是平衡，具体的使用方法及注意事项如下（由在各室上课的教师结合本室离心机进行现场指导）：五、注意事项（离心机使用注意）1.检查离心内、外套管应完整不漏，洗净离心管；2.待离心的物质装入离心管的量不应超过离心内套管体积的2/3；3.将一对离心管（含内、外套管）放在台秤上平衡，可调节离心管内容物的量，也可在内、外管间加水缓冲平衡；4.检查离心机可正常工作后，将一对平衡好的离心管按对称的位置放在离心机中；5.盖好离心机盖，打开电源开关，慢慢拨动变速旋钮（从0开始），使速度逐渐增加，记时，离心结束后，一定先将变速旋钮慢慢拨到0位，再关电源；待离心机停止运转后，再打开离心机盖，取出离心管，不许用手强行使离心机停止转动！6．用完后，将内外套管洗净，倒立放置，使其干燥，并在使用的登记薄签名。7.使用过程中，如出现故障，一定请本室的实验员排除，不许擅自处理。制丙酮干粉时的注意事项加入丙酮及加酸调pH时，都要边加边搅丙酮一定要远离明火调pH时，不许调过头.制丙酮干粉，要少量多次加入丙酮后，将沉淀充分搅起。