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大黄蒽醌类衍生物论文：5种大黄蒽醌类衍生物的同时测定及应用【摘要】目的建立同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的方法，优化大黄蒽醌的超声提取工艺。方法采用反相高效液相法，色谱柱：WatersC18柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液(3∶5∶2)；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：225nm。结果5种游离蒽醌均具有较宽的线性范围且呈良好的线性关系（R2=0.9987～0.9997），平均回收率为92.79%～99.28%，日内精密度为0.65%～1.71%，日间精密度为2.52%～3.46%。结论该方法成功应用于大黄活性物质的提取工艺优化，根据所建立的方法测得的5种游离蒽醌含量，确定了大黄蒽醌的最佳超声提取工艺为：以70％乙醇为溶剂、料液比为1∶30(g∶ml)、超声提取2次、每次提取20min。【关键词】超声提取；大黄；RP-HPLC；蒽醌Abstract：ObjectiveTodevelopamethodforthesimultaneousdeterminationoffiveanthraquinonederivatives(aloe-emodin,rhein,emodin,chrysophanolandphyscion)inrhubarb,andtooptimizetheultrasonicextractionconditions.MethodsRP-HPLConaWatersC18column(250mm×4.6mm,5μm)wasused.Themobilephasewasmethanol-acetonitrile-0.01%phosphoricacidsolution(3:5:2),ataflowrateof1.0ml/min,andthedetectionwavelengthwas225nm.ResultsThelinearrangesofthefivefreeanthraquinoneswerewide,showinggoodlinearcorrelationswithcorrelationcoefficients(R2)of0.9987to0.9997.Theaveragerecoverieswerefrom92.79%to99.28%.Whiletheintra-dayandinter-dayprecisionwere0.65%～1.71%and2.52%～3.46%,respectively.ConclusionThroughthecontentsoffiveanthraquinonederivativesobtainedbythedevelopedRP-HPLCmethod,theoptimumultrasonicextractionconditionsaredeterminedasfollows:using70%EtOHasextractingsolvent,thesampleisextractedtwotimesandeachtimefor20minbyaultrasonicprocessor,whenthesolidtoliquidratiois1:30(g/ml).Keywords：Ultrasonicextraction;Rhubarb;RP-HPLC;Anthraquinones大黄RadixetRhizomaRhei为蓼科植物掌叶大黄RheumPalmatumL.，唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.exBalf或药用大黄RheumofficinaleBaill的干燥根和根茎，味苦、性寒。临床研究证实，大黄具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤和抗炎、泻下作用及抗菌性、止血性等多种生物学活性［1］。其主要有效成分为蒽醌类衍生物,包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚以及与葡萄糖结合成苷。5种蒽醌是大黄以及衍生中药大黄属［2］质量控制的基础。大黄中蒽醌的分离和测定方法有薄层色谱法(TLC)［3］，高速逆流色谱法(HSCCC)［4，5］，胶束电动毛细管色谱法(MEKC)［6］，毛细管区带电泳法(CZE)［7］，高效液相色谱法(HPLC)［8］，加压毛细管电色谱(pCEC)［9］。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最普遍和常用的分析方法。本文建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的RP-HPLC法，旨在确定大黄蒽醌的最佳超声提取工艺，同时可应用于大黄药材及其制剂质量的定量评价，为大黄药材的有效开发和利用提供依据。1仪器与材料Agilent1100型高效液相色谱仪（四元梯度泵，DAD检测器，HPChemStation色谱工作站，美国安捷伦科技），上海BRANSONSB2200超声波发生器，D1810C型电子分析天平（上海申生科技有限公司），R-201型旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品购自中国药品生物制品检定所；四川产大黄药材购于湖南国杏中药饮片有限责任公司，经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定为正品。药材于40℃干燥、粉碎过40目筛，贮于干燥器中置暗处保存备用；甲醇、乙腈、磷酸均为江苏汉邦科技有限公司生产的色谱纯，二次蒸馏水，乙醇、醋酸乙酯、石油醚、正己烷等均为北京化工厂生产的分析纯试剂。2方法与结果2.1HPLC-DAD分析条件色谱柱为WatersPAHC18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；柱温：25℃；进样量：20μl；流速：1.0ml/min；检测波长225nm。流动相为甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液(3∶5∶2)。试样过0.45μm的微孔滤膜后进行HPLC分析。2.2标准溶液的配制2.2.1标准储备液精密称取5种对照品适量，加甲醇配制成含芦荟大黄素（135μg/ml），大黄酸（105μg/ml），大黄素（90μg/ml），大黄酚（90μg/ml），大黄素甲醚(75μg/ml)的标准混合储备液。于4℃下冷藏，备用。2.2.2工作标准液临用前精密吸取适量加甲醇配制成每1ml分别含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为13.5，10.5，9，9，7.5μg的工作标准液。2.3样品溶液制备称取0.5g大黄细粉，用15ml溶剂（正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水）进行超声提取,抽滤，滤液于40℃下真空旋转蒸发至干，后用甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，于4℃下冷藏，备用。2.4方法学实验2.4.1色谱分离在拟定的色谱条件下，得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的标准色谱图(图1a)以及大黄药材样品的色谱图(图1b)。由图1可知，样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚与相邻组分的分离度Rs1.5,达到基线分离。2.4.2线性关系取混合标准储备液适量，用甲醇稀释成一系列不同浓度的标准溶液，分别进样3次，以标准溶液浓度X对峰面积Y进行线性回归，各组分在各自浓度范围内线性关系良好。结果见表1。表15种标准品线性范围，线性方程和回归系数（略）2.4.3精密度考察精密度分为日内精密度和日间精密度。对同一工作标准液在日内连续进样5次，得日内精密度，结果测得峰面积的RSD为芦荟大黄素0.65%，大黄酸1.09%，大黄素0.98%，大黄酚1.39%，大黄素甲醚1.71%；在连续3d内分别测定5次得日间精密度，结果测得峰面积的RSD为芦荟大黄素3.46%，大黄酸2.52%，大黄素3.26%，大黄酚3.15%，大黄素甲醚3.06%。2.4.4重复性考察在上述色谱条件下，对同一批样品按样品溶液的制备方法平行制备6份，分别进样20μl，进样测定，按外标法测定含量并计算RSD，芦荟大黄素2.52%，大黄酸2.20%，大黄素2.10%，大黄酚2.07%，大黄素甲醚2.89%。2.4.5准确性（加样回收率实验）取已知含量的大黄药材细粉适量，精密加入对照品适量，振摇，其余按样品溶液的制备方法，在上述相同色谱条件下分别进样，按外标法测定其含量,计算加样回收率和RSD。结果见表2。表2测定方法回收率结果（略）2.5方法的应用－最适超声提取工艺的确定称取0.5g大黄细粉，用50ml溶剂（正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水）进行超声提取30min,抽滤，滤液于40℃下真空旋转蒸发至干，后用甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，于4℃下冷藏，备用。在上述色谱条件下对各提取液进行HPLC分析，测定其中5种游离蒽醌含量。结果见表3。表3溶剂对游离蒽醌提取率的影响（略）表3结果表明，正己烷等低极性溶剂提取大黄游离蒽醌效率低，而甲醇，乙醇提取率高，在水中提取效率很低，且提不出大黄酸，这是因为其在水中溶解性小。大黄游离蒽醌中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素在以80%甲醇作为提取溶剂时，提取率最高；大黄酚、大黄素甲醚在以甲醇作为提取溶剂时，提取率最高；游离蒽醌提取效率次高的为70%乙醇。考虑到甲醇有毒，不宜用于食品和药物的加工，而乙醇从自然得来，成本低等诸因素，我们认为70%乙醇最合适。以70%乙醇为提取溶剂，其他条件不变，考察不同超声提取时间（10，20，30，40，60min）对5种游离蒽醌提取率的影响：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素在20min时提取率最高（2.092，2.913，2.497mg/g），大黄酚、大黄素甲醚在40min提取率最高（5.069mg/g、1.294mg/g），在20min时次之（5.042mg/g，1.286mg/g），综合考察选择20min为提取时间。以同样的方法，分别考察了不同料液比（1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50g/ml）以及超声提取次数对提取效率的影响。结果显示，5种大黄游离蒽醌在1∶30料液比时提取效率最高；超声提取两次最为合适。3结论本文建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的RP-HPLC法，该方法测定5种游离蒽醌的日内和日间精密度RSD分别在0.65%～1.71%和2.52%～3.46%之间，准确度高；回收率在92.79%～99.28%之间；具有宽线性范围和良好的线性关系（R2在0.9987～0.9997之间）。所建立的方法应用于大黄活性物质的提取工艺优化，确定了大黄蒽醌的最佳超声提取工艺为：以70％乙醇为溶剂、料液比为1∶30(g∶ml)、超声提取2次、每次提取20min。本实验为大黄的进一步研究和开发奠定了良好的基础。【参考文献】［1］WHO.WHOMonographsonSelectedMedicinalPlants［M］.WorldHealthOrganization,Geneva,1999:231.［2］KuoChing-Hua,SunShao-Wen.Analysisofninerhubarbanthraquinonesandbianthronesbymicellarelectrokineticchromatographyusingexperimentaldesign［J］.AnalChimActa,2003,482:47.［3］SinghNarendraP,GuptaAjaiP,SinhaArunK,etal.High-performancethinlayerchromatographymethodforquantitativedeterminationoffourmajoranthraquinonederivativesinRheumemodi［J］.JChromatogrA,2005,1077:202.［4］YangFuquan,ZhangTianyou,TianGuilian,etal.Preparativeisolationandpurificationofhydroxyanth