奶粉中蛋白质含量的方法[1]

【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA（二喹啉甲酸）法，在570nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250μg/ml范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。【关键词】奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺ArapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkZhangZhiqiao,ShenGuodong,WangGangFirstMiddleSchoolofHefei,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001［Abstract］ObjectiveToexplorearapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkwithoutothernitrogen-containingcompounddisturbanceinKjeldahldetermination.MethodsConjugatedwithproteinprecipitationwithtrichloroaceticacid,BCA(bicinchoninicacid)methodwasused.Accordingtothepositiverelationshipofproteincontentwiththe570nmabsorbance,proteincontentwascalculatedinpowderedmilk.ResultsProteincontentinmilksolutionshowedagoodlinearrelationshipatthedetectionrangesof0-250μg/ml,withregressionequation:Y=301.12X-73.42andrelatedcoefficient:0.998,andtheaveragerecoveryratewas100.2%.ConclusionBCAmethodconjugatedwithtrichloroaceticacidisadaptabletotherapidandsensitivedeterminationofproteininpowderedmilk.［Keywords］Powderedmilk;Protein;BCAmethod;Trichloroaceticacid;Melamine蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多,如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用BCA（二喹啉甲酸）法结合三氯乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含量的方法。1材料与方法1.1仪器与试剂1.1.1仪器酶标仪（型号ELX800，BIO-TEKINSTRUMENTS公司），96孔微孔板，化学分析滤纸（直径：9cm，最大孔径：10μm，杭州新华纸业有限公司），玻璃漏斗、烧杯等。1.1.2试剂光明全脂速溶奶粉（黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司，产地：齐齐哈尔，生产日期：20081010），蒙牛学生多维高钙高锌奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，产地：呼和浩特，生产日期：20081207），尿素（分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司），三聚氰胺（化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司），硝酸铵（分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司），三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），BSA（牛血清清蛋白，美国Sigma公司）BCA试剂盒（PIERCE公司，BCA23225），去离子水。1.2实验方法1.2.1方法原理据资料介绍，BCA法是目前已知的一种敏感准确的蛋白质测试法，广泛用于国内外企业和科研院所进行蛋白质含量检测。其主要原理是：要分析的蛋白质在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，Cu+与BCA形成一种紫色化合物，其吸收峰在562nm波长处。BCA法定量分析蛋白质具有准确灵敏（20～2000μg/ml）、快速（约40min）、稳定和经济实用（可以用试管或微孔板测定），以及它是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强等特点。三氯乙酸沉淀蛋白质的主要原理：三氯乙酸作为蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚集沉淀。据文献报道，三氯乙酸比硫酸铜等物质能更好地排除非蛋白氮对溶液中蛋白氮的影响，具有广泛的适用性。1.2.2标准应用曲线的绘制配制2mg/ml牛血清清蛋白（BSA）溶液作为标准蛋白质储存液（含有9g/L氯化钠），参照BCA试剂盒说明书所示方法，按表1所示配制不同浓度BSA工作液，用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12000r/min离心30min，吸取上清液待测；以9g/L氯化钠溶液为空白对照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入200μlA液与B液（10A∶1B）的混合工作液，60℃水浴30min，用酶标仪在570nm波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质质量浓度为横坐标，计算标准回归方程并绘制工作曲线。表1不同浓度BSA工作液的配方（略）1.2.3样品制备与测定准确称量牛奶粉150mg/份和300mg/份各4份，分别倒入贴有1、2、3、4、5、6、7、8标签的8个50ml离心管中，再分别称量20mg的硝酸铵、三聚氰胺和尿素各2份，按表2示倒入对应的离心管中。加入适量60℃9g/L氯化钠溶液充分溶解，并用100ml容量瓶定容至刻度。用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12000r/min离心30min，吸取上清液待测；以9g/L氯化钠溶液为空白对照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入200μlAB（10A∶1B）混合液，60℃水浴30min，用酶标仪在570nm波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，从标准工作曲线上查出对应的蛋白质浓度。表2待测样品组成（略）1.2.4分析结果的表述与计算样品中蛋白质的含量X按式(1)计算：X=10C·F(1)，式中：X-样品中蛋白质的含量，g/100ml(g)，C-测定样品溶液中蛋白质含量（mg/ml），F-稀释倍数。1.2.5允许差同一样品的两次测定结果之差，不得超过平均值的51%。2结果2.1标准工作曲线及线性范围以BSA各级工作液的蛋白质浓度（Y，μgmoL-1）对其OD值（X）作图，结果表明蛋白质浓度在0～250μg/ml范围内标准工作曲线呈线性关系，标准曲线方程：Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998。见附图。附图蛋白质含量测定的标准曲线2.2样品测定中干扰因素的影响取上述添加了不同干扰物质的样品，按上述实验方法进行操作，结果发现，在60℃的水中三聚氰胺等添加物质都能充分溶解，只是过滤速度表现不一样：添加了三聚氰胺的奶粉溶液过滤速度最快（3号和7号管分别用时为19min和21min），添加了尿素的奶粉溶液次之（4号和8号管分别用时为79min和92min），添加了硝酸铵的奶粉溶液最慢（2号和6号管分别用时为112min和124min）。分别收集滤液和三氯乙酸沉淀后的上清液进行BCA法检测蛋白质含量，测得各项实验数据如表3。结果发现三种不同的非蛋白质的含氮化合物基本不影响蛋白质含量的正确测定：质量150mg的奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为35.72mg，标准方差为1.38mg；质量300mg的奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为62.13mg，标准方差为1.43mg；分别与空白对照的34.96mg和65.56mg，以及厂家奶粉中蛋白质标示量36mg和72mg相比，二者差异都不明显。同时实验结果也表明本实验所用奶粉的蛋白质含量达到国家要求（我国《食品营养标签管理规范》的技术附件中规定，对于蛋白质和碳水化合物，其允许的误差范围是≥80%标示值）。表3不同样品蛋白质含量测定（略）2.3方法的加标回收率分别取奶粉1（光明全脂速溶奶粉，其稀释液为稀释液1）和奶粉2（蒙牛学生多维高钙高锌奶粉，其稀释液为稀释液2）加入60℃9g/L氯化钠溶液进行1/1000样品稀释，做方法加标回收试验，结果见表4，该方法的平均加标回收率为100.2%。表4方法的加标回收率3讨论奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作的一项重要指标。目前国内主要采用常规凯氏定氮法，国外也多采用常规或改良的凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，但此法费时、费水、费电，操作繁琐，试剂消耗量大，且不能有效区分非蛋白氮［2、3］。常见的含氮化合物如硝酸铵和尿素比牛奶蛋白质的含氮率都高，易溶于水，很容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺虽然常温和冷水状况下在水中的溶解度非常低［4］，但是人们平时习惯上和奶粉说明书上都要求用温开水冲调，例如60℃时三聚氰胺在100g水中可以溶解1.8g，100℃时溶解6.4g，因而掺伪问题容易受到人们的忽视。国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量测定方法的研究，例如，云南工业大学张惠芬等探讨了在奶粉、豆奶粉、鱼粉中人为掺入尿素、硫酸铵等含氮化合物对蛋白质测定的影响，结果表明：用95%乙醇能很好地将尿素与食品中蛋白进行分离，回收率较高，并能方便、快速测定掺入量。对掺入硫酸铵等无机铵盐的测定，采用加MgO调到弱碱性，直接蒸馏测定［5］。成都理工大学李海玲等通过对Lowry法、BCA法、磺基水杨酸沉淀法、Bradford法等4种常用蛋白浓度测定方法的研究认为，确定PEG-IL-6的最佳蛋白浓度测定方法为BCA法，而包涵体变性液中的蛋白浓度只能用Bradford法测定［6］。中国农业大学食品科学与营养工程学院牛巍等利用三氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸铜沉淀蛋白法对添加了非蛋白氮的液态奶进行蛋白氮测定。结果表明，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋白氮对液态奶蛋白氮测定的影响［7］。河北省衡水市疾病预防控制中心田志梅等分别运用紫外分光光度法及甲醛值滴定法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量。结果显示，两种方法均可有效解决非蛋白质类含氮物质对牛奶中蛋白质测定结果的干扰问题［8,9］。中国农业大学侯彩云等使用三氯乙酸使蛋白质沉淀后，不同含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不同的蓝紫色的络合物，根据其色度值与蛋白氮含量高低呈线性相关关系，用计算机软件自动分析获得的样品色度值，从而计算出蛋白氮含量［10］。综上所述，目前国内用于测定奶粉中蛋白质含量的方法有多种，其测定原理及结果的准确性各不相同，每种方法都有其优点及局限性。相比较而言，本项目运用BCA法结合三氯乙酸沉淀蛋白法检测奶粉中蛋白质的含量，可以有效排除三聚氰胺等非蛋白氮的干扰，具有简便、快速、准确、实用的特点，可作为检测机构和平时人们准确检测蛋白质含量时考虑运用的方法之一。奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分