图像分析201410

第七章组织化学与免疫组织化学定量分析技术显微图像分析流式细胞术激光扫描共聚焦显微镜技术第一节、显微图像分析显微图像分析系统组成imageanalysissystem像素灰度色彩长度面积光密度基本术语和常用测量参数是构成显示器图像的最基本单元，按行和列（X和Y）方向排列成矩列。任何一矩列均对应一个点，这些点称为像素。单位面积屏幕上像素愈多则图像愈清晰。每个像素含有两方面信息像素在标本中的位置像素的灰度像素灰度指图像每一像素的明暗（深浅）程度，即该像素的图像由黑到白变化的量化等级。阈值20，50荧光照片荧光照片本质上是单色图片。一般只有一种颜色。所以拍摄荧光照片时，最正规的方法是拍摄灰度图片。色彩伪彩色图像（假彩色图像）：根据灰度值人为地设定不同的颜色。真彩色图像：是由图像采集装置将每一像素的真实色彩分解为红、绿、蓝三种原色信号，每种原色信号又有其灰度等级，最终再通过计算机重新编码还原为彩色图像。例1：甲状腺模型长度面积图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。统计分析结果输出标本的形态参数例数细胞数核面积（μm2）核周长（μm）最长径（μm）最短径（μm）正常632422.27±?7.6320.05±4.317.13±1.564.36±0.90乳癌946242.81±15.9026.49±5.519.10±1.836.30±1.22P值0.010.010.010.01对乳腺癌细胞形态定量分析光密度是指光线通过某一物质前与通过后的光强度(Io与Ib)比值的对数值，即log(Io/Ib)。光密度值与物质含量成正比关系，光密度值越小说明光线被吸收的程度越小，物质含量则越低。吸光和发光组织样品的常用测量参数吸光组织细胞样品的测量积分光密度又称积分吸光度，是被测量范围内各像素吸光度的总和，表述测量范围内各像素吸光物质的总含量，测量范围可为面积或体积。平均光密度又称平均吸光度，是被测量范围内各像素吸光度的算术平均值，表述被测量范围内各像素吸光物质含量的平均水平，可反映此范围的染色深浅程度。反映被测量范围内各像素染色深浅差异的指标，称为平均光密度方差，是表述被测量范围内各像素间吸光度的离散程度。发光组织细胞样品的测量积分光强度被测量范围内各像素光强度的总和，表述测量范围内各像素发光物质的总含量，测量范围也可为面积或体积。平均光强度被测量范围内各像素光强度的算术平均值，表述被测量范围内各像素发光物质含量的平均水平，可直观地反映此范围的亮度。反映被测量范围内各像素间亮度强弱差异的指标，称为平均光强度方差，表述被测量范围内各像素间光强度的离散程度。每次均在开机20分钟后，在40倍物镜下采集图像。从每张切片中选取一有代表性区域，连续取20个高倍视野（×400倍）分别对免疫组化染色胞浆中的阳性表达进行定量分析，计算每视野阳性染色的光密度（OD）值和积分光密度（iOD）值，并取20个视野的积分光密度之和。肩袖撕裂患者肩峰下滑囊(SAB)及正常对照组IL－6免疫组化染色切片图像，采用积分光密度评价阳性表达结果显微图像分析处理程序制作切片样品获取图像在计算机屏幕上显示的数字化显微图像右图：暗且偏蓝的背景严重影响到了阳性区域的色调。而且降低了黄色象素点的IOD值。这会严重影响分析结果。有的CCD具有手动较正色温的功能，可以较正一下背景色调，但暗背景既使不偏色也是影响分析结果的。较暗的背景值对分析结果的影响0.20.11.01.21.100.40.81.21.6阳性样品阴性样品背景背景+阳性样品背景+阴性样品显著性差异无显著性差异扣背景后依然没有显著性差异阳性样品1.20.1阴性样品1.10.1背景10.1阳性样品-背景0.20.1阳性样品-背景0.10.11.11.20.10.21.000.40.81.21.6阳性样品阴性样品背景阳性样品-背景阳性样品-背景注意误差线增大了，依然没有显著性差异图像分割将图像中需要测量的目标从背景中分割出来测量统计分析结果输出计数阳性细胞数显微图像分析应用中的注意事项设计在先，测试在后明确需要测量分析的对象实验操作过程的一致性图像分析系统输入条件的一致性图像分析系统现有参数的局限性二维定量信息的局限性图像获取的标准化是指将在图像输入过程中保证设备参数的一致性。设备参数包括图像尺度(即放大倍数)、光源亮度、图像空间分辨率、图像格式等。在输入过程中,应分别根据感兴趣区的大小和灰度(或颜色亮度)确定图像尺度和光源亮度。图像处理的目的是改善视觉效果,突出感兴趣区,便于进行进一步的图像分析。此外,免疫组化染色会产生一定的背景色,即非感兴趣区会有一定程度的染色,这会对后期图像分析造成影响。在图像处理时,应在图像中减去背景色,将本底灰度设为零,为此可对图像进行进一步的校准。总结拍摄注意事项：调整显微镜光源亮度(电压9伏)，足够白，足够亮。调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件(曝光及白平衡设置)一次拍摄完所有照片。保存照片为TIFF格式。象素不必太大。优点首先,图像处理方法可以进行精确的定量分析,能够将切片图像中目标的细微差异反映出来。其次,计算机分析可以对整个视野图像进行分析,使得短时间内处理大量切片图像成为可能,从而增加了处理样本的范围,提高了结果的准确性和可信度。计算机分析方法可以大大减少分析过程中的人为因素影响,保证了分析结果的客观性。