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1一、实验目的1.圆二色性；2.圆二色光谱的原理与应用；3.圆二色光谱的相关拓展知识；4.圆二色光谱的实验技术与操作。二、实验原理圆二色性是手性分子在光学上表现的一种特性。光可视为振动方向与传播方向垂直的电磁横波。当光波的电矢量方向以一个固定的角速度以传播方向为轴心匀速旋转时，称之为圆偏振光。根据圆偏振光电矢量旋转方向的不同，可以将其区分为左圆偏振光和右圆偏振光。一束平面偏振光可以看成是由两个振幅和速度相同而螺旋前进方向相反的圆偏振光叠加而成（图1）。两圆偏振光彼此对映，互为镜像。当手性物质在偏振光的波长范围内存在吸收的时候，其对左右圆偏振光的吸收程度，也就是摩尔吸光系数，是不同的。此时不但偏振光的偏振平面将被旋转，构成该偏振光的左右圆偏振光的振幅也将不再相等。组成出射光的左右圆偏振光的电矢量和将沿一个椭圆轨迹移动，此时的出射光就是椭圆偏振光（图2）。这种光学现象就称为手性物质所具有的圆二色性。对于纯手性物质，其椭圆偏振光的椭圆度θ在特定溶剂、浓度、温度和光程下，在特定波长处为定值。同时，在特定波长处的椭圆度θ与在该波长处对左右圆偏振光的摩尔吸光系数之差(Δε)成正比。将θ或Δε对波长作图，即得到圆二色光谱。图1右圆偏振光(a)、左圆偏振光(b)及平面偏振光示意图，水平箭头表示光的传播方向。2图2(a)平面偏振光的圆组分；(b)平面偏振光的旋转与圆组分；(c)椭圆偏振光的旋转与圆组分被吸收的情况。其中，OB与OC分别表示右、左圆偏振光被吸收后的振幅，OD表示OB与OC的矢量和，θ表示椭圆偏振光的椭圆率角，tanθ=OE/OA″≈θ。圆二色光谱的英文名称为CircularDichroism，简称CD光谱。其光谱仪的基本测试原理是——通过入射圆偏振光的波长变化，测定手性样品的左圆偏振光和右圆偏振光摩尔消光系数之差Δε。由于CD光谱反映了光和分子间的能量交换，因而只能在有最大能量交换的共振波长范围内测。CD光谱可用于分析一般电子光谱所不能体现出来的能级跃迁的细节，是讨论手性化合物电子跃迁性质的重要表征手段。当测试条件严格一致时，一对对映异构体的CD光谱呈镜像对称。通常采用光学纯的样品（即仅含单一对映体）进行CD光谱的测定，可由实验值θ根据浓度c、光程长l求出该纯样的Δε。在严格相同的测试条件下，测定未知样品的CD光谱，可根据实验值求出未知样的Δε’。根据上述数据可估算未知样品的对映体过量值（EnantiomericExcess，简称ee%）。当样品溶解性差、溶剂背景干扰、溶解过程中绝对构型发生变化时，固相CD光谱测试很有必要。通常对纯样进行CD光谱的测试，可在样品绝对构型与CD信号间建立关联。对同物质未知ee%值的样品，可通过CD光谱，简单判断其哪种对映体过量。此外，光谱还可结合其他结构表征手段用于关联确定手性化合物的绝对构型，或检测靶向分子与DNA等生物大分子的相互作用。3图3圆二色光谱仪示意图如图3所示，圆二色光谱仪由氙灯光源、单色系统、偏振系统、样品台、光电倍增管等部件组成。具体参数如下：光源两种标配灯:150瓦氙灯及150瓦汞氙灯可同时装置。分离式光源装置，205nm以上测量不需使用氮气，波长205nm以下氮器使用量3升/每分钟。单色器光栅：双光栅1200条/mm。波长設定范围：185至800nm。光学系统全反射消色差的光学系统，氟化镁（MgF2）偏振光学组件，具参比二极管检测器。数据采集及数据分析采样速率：10微秒/每点-1000秒/每点。波长扫描速度：最高1200nm/min(0.05秒to20秒/每点)。圆二色测量噪声：0.01mdeg°(2nm，1sec)。基线稳定性：0.01mdeg°/小时。CD分辨率：最低达0.0006mdeg。CD测量范围：最高达±6500mdeg。三、应用案例设计41、仪器和药品：（1）、药品：KCl(光谱纯)、纯手性试剂、无水乙醇（A.R.）。（2）、仪器：MOS-450圆二色光谱仪，分析天平，压片机（包括压模等），玛瑙研钵。2、实验步骤：电源依次打开ALX-250光源开关（先开光源盒背后开关，再开光源盒面板开关），MM-450电源开关，计算机电源，预热半小时。查看ALX-250面板显示功率，微调旋钮，将功率确定在150W。制备样品固相压片样品：采用KCl压片法。以光谱纯KCl（需自备）为惰性介质。压制纯KCl片为空白样，待测样品与KCl分别以1：25、1：50、1：100、1：200比例混合压片为试样片，二者质量皆取25mg，以确保厚度一致，透光度好。开启程序1.点击电脑桌面上的“BioKine”图标，进入BioKine软件操作主界面。2.点击操作主界面的Device/ScanningSpectrometer，进入光谱扫描界面。安放空白样固相压片样品：取下光电倍增管，将带有纯KCl压片的模具置于样品台上，凹口向内垂直放置，将光电倍增管罩住固体压片模具，锁紧螺丝。空白样扫描与扣除1.根据样品的最大吸收波长，输入到操作界面下方的“Ex”处，回车。2.点击按钮变为，然后点击，自动调整HV电压，然后再点击按钮，锁定此电压值。3.点击主界面上方的按钮，进行测试参数的设置：a)Acquisitionmode：选择测量模式CD；b)Begin(nm)：扫描初始波长；c)End(nm）：扫描结束波长；d)ScanRepeat：扫描次数；e)Acquisitionduration：每个nm的测量持续时间，范围0.05s-20s。此数值越长，则扫描时间越长，信噪比越优；f)ShutterAutomaticmode：选择Alwaysopen；g)PMgain*10：当在非常低的信号测量，可选择此项，进行信号的增益。h)CDparameters：CD的灵敏度，根据信号的振幅设置，有四个不同的选项，1000、300、100和30mdeg。上述选项，b)、c)项应根据试样的紫外可见吸收谱带选定，其他参数可选用默认值。以上参数都设置好后，点击OK按钮，参数设置完成，回5到主界面。4.点击主界面左方Blankspectrum区域的Record按钮，进行空白样的扫描。5.扫描完成后，在第四步的操作区域内，选中Subtract复选框，将在随后进行的试样光谱测试中扣除空白值。样品的测量1.再点击按钮关闭挡板，点击按钮变为。将空白样品替换成待测样品，放置方法与空白样相同。2.这时再点击打开挡板，点击按钮变为，然后点击，自动调整HV电压，然后再点击按钮，锁定此电压值。3.点击主界面Acquisitioncontrol区域的按钮，进行待测样品的圆二色光谱扫描。谱图数据的保持选择主界面的File菜单下的SaveAs…。注意选中左下角的“SaveAsText”复选框，则保存的bka文件可由记事本打开。仪器的关闭光谱扫描完毕，务必先取出样品。关闭操作软件主界面，关闭MM-450电源开关，ALX-250光源开关（光源盒背后开关）；关闭计算机，最后关闭外部电源插座。注意事项1.每次更换测试样，请确认如下两点：a)光电倍增管处于关闭状态：软件主界面下方的电压提示处于“”状态；b)挡板处于关闭状态：软件主界面下方显示处于灰色的“”状态；2.对于固相样品测试，需移动光电倍增管的情况，光电倍增管需轻拿轻放，请避免剧烈振动。3.光谱扫描时，请避免实验台面的剧烈震动。4.实验结束后，固相样品的压片模具严禁在潮湿状态下装入模具盒。为避免模具生锈，应在清洗后红外灯下烘干。确认干燥后装入模具盒，置于干燥器中。5.实验数据请存放于“I:\Data\”目录下。为便于管理，建议以导师姓名为文件夹名称。6.每次实验需拷贝的数据，请另存一份在电脑桌面，并将文件（或文件夹）6名称填写于电脑桌面“需传递数据.xls”文档中。请注明数据归属者姓名，电子邮箱及联系方式。数据拷贝将由管理人员每周传递1~2次。7.请做好实验登记工作，如实登记所测样品名称，仪器运行情况，以及实验时间。8.如需进行上述实验内容以外的测试，敬请联系管理人员。四、数据处理-30-20-10010203040200250300350400450500550600650Wavelength/nmθ/millidegree空白1:251:501/1001/200图4CD谱图因为波长在200nm至300nm时，电压大于600V，数据不准确，所以，当波长为200nm至300nm时，数据舍去不用。观察波长在300nm至650nm区间内空白片的摩尔椭圆度θ数值基本处于0以下，而样品片在此段波长内的摩尔椭圆度θ则基本大于0；并且，对于含有不同浓度的样品的测量，其摩尔椭圆度θ随着浓度的增大而呈现下降趋势，可以推测出样品为右旋手性物质，且在紫外可见区域有吸收特征。五、思考题1.试用一句话简述CD光谱的原理。答：手性物质具有圆二色性(circulardichroism，简写作CD)，圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光，且只在发生吸收的波长处才能观察到。2.哪些物质需要收集CD光谱？CD光谱可以提供哪些信息？答：CD光谱的测量条件：在给定波长范围内有较强的CD信号和合适吸收值的手性物质。CD光谱提供信息：圆二色谱在有机化合物结构鉴定中有着广泛的应用。可见及近紫外作为入射光源，这就要求被研究的手性分子要具有发色基团，通过对发色基团的研究来获得分子结构信息，因此它只能提供分子局部的结构信息。主要用于测定蛋白质的立体结构圆二色性R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象。圆二色谱是一种测定分子不对称结构的光谱法。在7分子生物学领域中主要用于测定蛋白质的立体结构，也可用来测定核酸和多糖的立体结构。3.以固相或液相样品为例，试讨论对未知样品进行CD光谱测试，应如何设计实验方案？答：以液相为例：（1）CD测试前进行UV测试，可找出其理想的测试光谱范围。（2）选择超纯试剂（光谱纯），清洁无暇的比色皿以及合适的溶剂，浓度一般以Abs=0.8时为宜；（3）配置合适的浓度，在CD仪器上选择合适的狭缝，对最大波长进行单点测试，使得电压在合适的范围测试电压均不应高于400V；（4）对合适浓度的溶液进行测试；（4）对于紫外和可见分别有吸收不能再相同浓度得到很好表现的的可以进行分段测试；（5）分析图谱，更改条件（如：溶度，测试步长、狭缝等）得到满意的结果。（6）数据的定量分析通常采用光学纯的样品（即仅含单一对映体）进行CD收集，可由实验值θ根据浓度c、光程长l求出该纯样的Δε，根据上述数据可估算ee%4.你未来将开展的课题是否有可能用到CD光谱？答：不会用到