姜黄素单羰基类似物的体外稳定性及其抗肿瘤活性研究

姜黄素单羰基类似物的体外稳定性及其抗肿瘤活性研究杨苹1a隋思博2张敏1b梁广3王艳芳1a官丽莉1a李校堃1.3*（1.吉林农业大学a.教育部生物反应器与药物开发工程研究中心b.农业部参茸质量监督检验测试中心长春130118；2.吉林省食品药品检验所长春130033；3.温州医学院药学院温州325035;)摘要目的：研究姜黄素及合成的姜黄素单羰基类似物在体外的稳定性及其抗肿瘤活性。方法：将姜黄素及合成化合物加入到配制的溶液中，计算其在溶液中的降解率，并以此为指标，考察其在体外的稳定性；同时用MTT法分析其对肿瘤细胞生长的影响；结果：在相同条件下，姜黄素及其类似物的稳定性依次为：B类≥C类≥A类≥姜黄素，抗肿瘤活性依次为：B类≥C类≥A类≥姜黄素；结论：合成的姜黄素类似物不仅提高了体外的稳定性，且其抗肿瘤活性也优于姜黄素。关键词：姜黄素单羰基类似物稳定性抗肿瘤活性[中图分类号][文献标识码][文章编号]ResearchontheStabilityandAnti-tumorPropertieofMono-carbonylAnaloguesofCurcuminYangPing1aSuiSi-bo2ZhangMin1bWangYan-fang1aGuanLi-li1aLiangGuang3LiXiao-kun1,3*(1.JilinAgriculturalUniversity，a.EngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment，MinistryofEducation.b.GensengandantlerproductscentreoftheministryofagricultureChangchun130118；2.JilinInstituteofFoodandDrugControl，Changchun130033；3.SchooofPharmacy,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035)AbstractObjectives:Toresearchthestabilityandanti-tumorpropertieofmono-carbonylanaloguesofCurcumininvitro.Methods:Curcuminandsyntheticcompoundswereaddedthepreparationofthesolution，thedegradationrateofsolutionwasusedtoevaluatethestabilityinvitro.AtthesametimeusingtheMTTmethodanalyzedtheinhibitoryanti-tumorpropertieeffect[基金项目]吉林农业大学青年基金（No.201127）[作者简介]杨苹，女，硕士研究生，研究方向：中药新药资源开发与利用，Tel：[phone]，E-mail：[e-mail][通讯作者]李校堃，男，博士学位，教授，研究方向：中药新药资源开发与利用；Tel：[phone]，E-mail：[e-mail]:Underthesameconditions,thestabilityofCurcuminandCurcuminderivativesbycompoundBisbest,followedbycompoundCandthencompoundA,andtheanti-tumorpropertieaswell;Conclusions:Themono-carbonylanaloguesofCurcuminimproveboththestabilityoftheinvitroandtheanti-tumorpropertiecomparedwithCurcumin.Keywords:Curcumin；Mono-carbonylanalogues；Stability；Anti-tumorpropertie；1引言姜黄素是中药姜黄发挥药理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理活性[1]，其在抗肿瘤方面具有：抗肿瘤谱广、多靶点、逆转肿瘤多药耐药等优点引起了人们的广泛关注，美国国立肿瘤研究已将其列入第三代抗癌化学预防药，因此将其作为抗癌新药具有广泛的应用前景。但因其在体内稳定性差、半衰期短、代谢过快等药代缺陷[2]很大程度上限制了其在临床上的开发及应用。为此本实验室合成了一种新的姜黄素类似物，试图在提高其稳定性、改善其药代缺陷的同时，其药理活性不发生改变。本研究中对合成的姜黄素类似物进行了体外稳定性试验及肿瘤活性抑制实验，对合成化合物的设计思路进行了初步验证。2实验仪器及材料高效液相色谱仪(日本岛津公司，型号：LC-20A)；C18色谱柱（日本岛津公司，5μｍ×4.6×200mm，）；二氧化碳培养箱（日本三洋公司，型号：HF90）；酶标仪（美国分子生物，型号：PLUS384）；色谱纯甲醇、色谱纯乙腈购自Fisher公司。细胞株H460、HepG2由吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心细胞科室保存；二甲基亚砜/DMSO、3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐/MTT,为美国Sigma公司产品；细胞培养基RPMI1640、DMEM为GIBICO公司产品、胎牛血清FBS购自Hyclone公司、小牛血清为兰州民海生物工程有限公司产品、姜黄素对照品为国药集团上海化学试剂公司产品、化合物A、B、C(化学结构图见图1)由温州医学院梁广博士合成；精密称取姜黄素对照品及合成物A、B、C、分别用甲醇溶解，配制成总浓度为5mM的储备液，备用；其余试剂均为国产分析纯。图1.化合物A、B、C化学结构图3实验方法3.1色谱条件：流动相姜黄素：乙腈-水（体积比45：55），含1%（体积分数）乙酸；受测化合物：乙腈-水（体积比70：30），含1%（体积分数）乙酸；检测波长姜黄素420nm、受测化合物361nm；流速：1.0mL.min-1；柱温：30℃；进样量为20μL；3.2体外稳定性试验加入精密量取配制好的姜黄素及受测化合物的储备液20μL，加入pH7.2的磷酸盐缓冲液定容至1ml，37℃避光放置；分别在0、2、6、12、24、32、48和72h取样，处理样品（取100μL混合液加入甲醇定容至1ml，过滤），取20μL进样，HPLC分析，根据其峰面积计算姜黄素及受测化合物的降解率：%100h0h72h0%峰面积峰面积峰面积降解率[3]3.3姜黄素及其单羰基类似物对肿瘤细胞的增殖影响取对数生长期的细胞，用含10%FBS/小牛血清的RPMI1640/DMEM培养液培养的肿瘤细胞（人肺癌细胞H460培养条件为：含10%FBS的RPMI1640培养液，人肝癌细胞HepG2：含10%小牛血清的DMEM培养液）以1.5×104/孔接种于96孔板,37℃5%CO2的培养箱中培养24h,之后加入不同浓度的姜黄素、受测化合物、顺铂（阳性对照），阴性对照组只加培养液，每组均设3个复孔,继续培养48h后，加入5mg/ml20μl的MTT,37℃5%CO2的培养箱中继续培养4h后，吸去上清液,每孔加入150μl的DMSO，用酶标仪震荡2-3min,测其吸光度（OD值），检测波长为570nm.，参比波长为630nm。计算各组样品3个复孔的平均值，计算细胞生长抑制率。实验重复三次，通过与姜黄素对照组比较，根据公式%10000CCCTRGR，50%1000050TCTGI[4-6]计算其相对增值率、50%抑制率。（T是实验组各时间段吸光度值，T0是零时间点吸光度值，C是对照组吸光度值,不加药组各时间点吸光度;C0为空白组吸光度值,不加细胞和药物,仅有培养基)，应用SPSS统计学软件进行数据分析。4．实验结果4.1体外稳定性试验将不同时间点取样，处理的样品进行HPLC分析，根据峰面积计算其在pH7.2的磷酸盐缓冲液中的降解率，以时间为横坐标，浓度为纵坐标作图，分析结果如图1（以0h的峰面积为100%计算）：姜黄素的降解率为：63.78%，化合物A、B、C的降解率分别为：34.57%、52.41%、46.38%，受测化合物的降解率均低于先导物姜黄素，说明其具有比姜黄素更好的稳定性。初步证明了去除不稳定β-二酮基团而使化合物结构更为稳定的设计思路是正确的。0204060801001200261224324872时间hHPLC峰值%姜黄素化合物A化合物B化合物C图1.姜黄素及合成物在磷酸盐溶液中的降解曲线4.2体外抗肿瘤实验实验使用MTT法测定姜黄素及合成化合物A、B、C对肿瘤细胞的抑制率，实验中选择了100mg.ml-1、10mg.ml-1、1.0mg.ml-1、0.1mg.ml-1、0.01mg.ml-1五个浓度进行其抗肿瘤抑制试验，实验结果见图2，实验结果显示：不同剂量的受测化合物A、B、C对肿瘤细胞呈现出不同程度的抑制率，且其抑制作用随着浓度的增高而逐渐增强，而且作用的时间越长，对肿瘤细胞的抑制作用也越强，（详见图3）作用48h的抑制作用要优于24h。在相同浓度时其对肿瘤细胞抑制作用强弱：B类≥C类≥A类≥姜黄素，合成化合物的抑制作用均优于先导物姜黄素，且化合物B的抑制作用优于阳性对照顺铂。同时，根据其吸光度计算其相对增值率(计算结果见表1，表2，)、50%抑制率(计算结果见表3，表4，)，计算所得的受测化合物的相对增值率、50%抑制率与姜黄素相比较强；进一步证明姜黄素单羰基类似物的设计思路是正确的。00.10.20.30.40.50.60.7阴性对照阳性对照姜黄素化合物A化合物B化合物C药物名称OD值100mg/mL10mg/mL1mg/mL0.1mg/mL0.01mg/mL00.10.20.30.40.50.60.7阴性对照阳性对照姜黄素化合物A化合物B化合物C药物名称OD值100mg/mL10mg/mL1mg/mL0.1mg/mL0.01mg/mLab00.10.20.30.40.50.60.7阴性对照阳性对照姜黄素化合物A化合物B化合物C药物名称OD值100mg/mL10mg/mL1mg/mL0.1mg/mL0.01mg/mL00.10.20.30.40.50.60.7阴性对照阳性对照姜黄素化合物A化合物B化合物C药物名称OD值100mg/mL10mg/mL1mg/mL0.1mg/mL0.01mg/mLcd图2：姜黄素及化合物A、B、C对肺癌细胞H460增殖的影响a肺癌H46024hb肺癌H46048hc肝癌H46024hd肝癌H46048h表1姜黄素及化合物A、B、C对肿瘤细胞细胞的相对增值率（24h）(3nsx)Cell/Conmg.ml-1Relativegrowthrate(%)姜黄素化合物A化合物B化合物CH460-1009.7±1.912.9±0.80.6±0.30.9±1.1H460-1014.1±2.019±0.57.9±1.513.5±0.2H460-127±0.332.7±1.315±1.219.7±0.3H460-0.152.1±2.143±1.527.9±1.530±0.5H460-0.0183.5±4.476.4±1.039.5±2.652.4±2.3HepG2-1003.7±0.31.3±0.40.8±0.72.8±0.6HepG2-1014.5±1.315.6±0.117.1±2.315±0.1HepG2-135.9±4.527.5±3.226.7±1.728.3±1.4HepG2-0.149.6±5.255.7±0.1332.9±4.145.6±3.3HepG2-0.0168.9±3.969.9±1.3556.4±3.359.5±11.3与对照组姜黄素比较：P0.05表2姜黄素及化合物A