土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选

土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选2013023123刘倩倩一、实验目的1.掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。2.了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。二、实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。三、实验材料（1）选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。配方：牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化钠5.0g可溶性淀粉10.0g琼脂20g蒸馏水1000ml调整pH至7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。（2）溶液或试剂牛肉膏1.25g蛋白胨2.5g氯化钠1.25g可溶性淀粉2.5g琼脂5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。（3）仪器或其他用品平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。四、实验步骤倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存（1）实验前准备制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。（2）制备土壤稀释液取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层5cm，去5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。（3）涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5-10min，使菌液浸入培养基。（4）培养将淀粉培养基平板倒置于30°C培养箱中培养1—3d。（5）初筛观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30°C的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。）（6）复筛测定其淀粉酶活。1）试剂和器材1.试剂：①碘原液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。②稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。③2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（PH为6）。④柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）45.23克，柠檬酸（C6H8O7?H2O）8.068克，加水溶解，稀释至1000毫升。⑤标准比色液：称取氯化钴（CoCL2?6H2O）25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01NHCL，其五倍稀释作标准。⑥样品：细菌-α淀粉酶2.器材①电热恒温水浴②试管③量筒④吸量管（1ml）3.操作方法：1)取试管1支，加20毫升2%淀粉，混匀，在30℃水浴中，使管内温度达到30℃。2)将淀粉酶0.5ml加到30℃的淀粉液中，混匀，在30℃水浴中保温，自加入记时，经5分钟后取反应液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的试管中。混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间。3)计算。在上述条件下，每一小时催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一个酶活力单位。(7)纯化并保存菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。同时，做好以下工作：①做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等。②防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在2—3只试管中备用。③原始菌种妥善保存。五、结果与分析1.分离到枯草芽孢杆菌菌的株数2.枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果