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孕期、哺乳期暴露十溴联苯醚对子代大鼠免疫功能的影响作者：周俊1；陈敦金2；廖秦平2；余艳红1(1南方医科大学南方医院妇产科，广东广州510515；2北京大学第一医院妇产科，北京100710)摘要：目的针对环境污染中十溴联苯醚对母婴健康存在潜在危害日益受到重视，研究经口胃灌十溴联苯醚对子代大鼠免疫功能的影响。方法对母代孕期前后及哺乳期持续高剂量胃灌十溴联苯醚后，观察其子代大鼠免疫器官发育情况、T淋巴细胞亚群及T淋巴细胞增殖转化功能、NK细胞表面分子CD161表达及免疫球蛋白(IgM、IgG)等变化。结果实验组免疫器官质量与对照组相比有变化，其T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+及NK细胞表面分子CD161+百分比、CD4+/CD8+比值下降，CD4-CD8-百分比升高。实验组T淋巴细胞增殖转化功能下降不明显，其IgM含量明显低于对照组，IgG含量变化不明显。结论母代持续暴露高剂量十溴联苯醚后，对子代免疫功能存在一定的不利影响。关键词：十溴联苯醚；免疫功能；大鼠中图分类号：R71文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)06-0738-04ImpactofPBDE-209exposureduringpregnancyandlactationonimmunefunctionofoffspringratsZHOUJun1；CHENDun-jin2；LIAOQin-ping2；YUYan-hong11DepartmentofGynecologyandObstetrics,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofGynecologyandObstetrics,FirstAffiliatedHospital,BeijingMedicalUniversity,Beijing100710,ChinaAbstract:ObjectiveToassessthepotentialhazardofenvironmentaldeca-brominateddiphenylether(PBDE-209)exposuretotheimmunefunctionoftheoffspringrats.MethodsTheparentalWistarratswereexposedtoPBDE-209administeredintragastricallyduringpregnancyandlactation,andthedevelopmentoftheimmuneorgansandchangesinTlymphocytesubsetandtheirproliferation,NKcellsurfacemarkersCD161andserumimmunoglobulins(IgMandIgG)wereobserved.ResultsSignificantdifferencesintheweightoftheimmuneorganswerenotedbetweentheexposuregroupandcontrolgroup.Intheexposuregroup,thepercentageofTlymphocytesubsetCD3+,CD4+,CD8+,CD4+CD8+,thepercentageofNKcellsurfacemarkersCD161andCD4+/CD8+ratiowerelowered,whilethepercentageofCD4-CD8-cellsincreased.Tlymphocytesubsetproliferationintheexposuregroupdidnotshowobviouslychanges,butcomparedwiththecontrolgroup,theIgMlevelintheexposuregroupwassignificantlylowered.NosignificanrdifferenceswereobservedinIgGlevelsbetweentheexposureandcontrolgroups.ConclusionContinuousexposuretohigh-dosePBDE-209infemaleratsduringpregnancyandlactationresultsinpossibleadverseeffectontheimmunefunctionoftheoffspringrats.Keywords:deca-brominateddiphenylether;immunefunction;rats收稿日期：2006-01-20基金项目：国家自然科学基金重大项目(40590390)SupportedbyaKeyProjectsponsoredbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(40590390)作者简介：周俊(1976-)，在读硕士研究生，E-mail:ice.zj001@163.com通讯作者：余艳红，副院长、妇产科主任，电话：020-61641907近年来随着工农业生产和电子技术的蓬勃发展，环境污染与日俱增，人们正生活在“环境激素的海洋”之中。一种叫做多溴联苯醚的阻燃剂在众多环境激素中日益受到关注。它是一系列含溴原子的芳香族化合物，根据苯环上溴原子的个数和位置的不同，它共有209中同分异构体，主要用于涂料、塑料制品、泡沫填充材料、纺织品、地毯等生活用品，以及电子电器商品、建筑材料、飞机、汽车等工业产品中，而且PBDE在这些产品中的比重占到5%～30%。它具有很强的脂溶性，可以沉积在生物体的脂肪组织并进行累积，并且还能通过母乳、胎盘、脐带血沉积到下一代的体内并损害下一代神经系统发育、引起甲状腺内分泌及免疫系统功能紊乱等，甚至有可能致癌[1][2][3]。因为它的化学结构和多氯联苯醚(PCB)相似，故两者毒性也存在相似之处，而PCB已被证明对孕妇及胎儿的免疫功能存在危害，并已被禁用[4][5]。目前国外医学界对低溴联苯醚相关毒性研究较多且肯定，但对于高溴联苯醚对机体是否存在危害具有仍存在争议，主要是由于高溴联苯醚能在光分解作用下脱溴，最后对对机体产生毒害的到底是高溴还是低溴联苯醚亦或两者均有之，国内外目前尚无定论[6][7][8]。此外对于多溴联苯醚类化合物对机体免疫功能影响的研究鲜见报道,而有关高溴联苯醚类化合物对机体免疫功能影响的报道更是少之甚少,国内尚无相关性研究报道。本研究模拟母代孕期前后及哺乳期持续高剂量十溴联苯醚(PBDE-209)经口胃灌的暴露方式，着重研究多溴联苯醚类化合物中含高溴即十溴联苯醚(PBDE-209)对其子代机体基本免疫功能的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1主要仪器和试剂Model550酶联免疫检测仪(美国BioRad公司)，LD25-2低速平衡离心机(北京医用离心机厂)，CO2培养箱(美国WTCB公司)，IMDM液(美国GIBCO公司)，PHA(华美生物有限公司)，LPS(华美生物有限公司)，CCK-8(株式会社日本同仁化学研究所上海代理公司)，新生牛血清(英韦创津生物有限公司)，Facscalibur流式细胞检测仪(美国Bectondickinson公司)，单克隆免疫荧光小鼠抗大鼠CD3，CD4，CD8，CD161抗体(FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8，FITC-CD161)及小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PEcy5(荷兰Serotech公司)，PBS(PH7.4，自配)，红细胞裂解液(自配)，1%多聚甲醛固定液(自配)、大鼠血清IgM及IgG定量检测ELISA试剂盒(晶美生物技术有限公司)。1.1.2实验动物刚断乳后(出生21d左右)的SPF级Wistar大鼠30只(购于南方医科大学实验动物中心)，其中雌性20只、雄性10只。1.1.3实验药物PBDE-209购自美国Sigma-Aldrich公司。1.2方法1.2.1动物模型建立分组：将20只雌性大鼠分为2组，A组自购买日始胃灌溶有PBDE-209(0.3g/kg·d)的花生油直至生育第一代仔鼠断乳，B组单纯胃灌等量花生油至第一代仔鼠断乳。取第一代仔鼠各15只做为观察对象，分为C组[断奶后继续胃灌溶有PBDE-209(0.3g/kg·d)的花生油至成年]、D组(断奶后继续单纯胃灌等量花生油至成年)。将C、D两组做为主要观察对象。喂养方法：按SPF级饲养，自由采食，饮水，采光，自然日夜周期，胃灌时间均在每日傍晚。性成熟期大鼠按雌雄2∶1比例合笼。自然妊娠，分娩子代大鼠。1.2.2大鼠脾及胸腺细胞悬液制备3%戊巴比妥钠按45mg/kg剂量，腹腔麻醉大鼠后，无菌取脾及胸腺，电子天平称重并计算其指数(脏器指数=脏器mg/体质量g)。用5ml注射器针芯及100目不锈钢滤网分别碾磨胸腺及脾，分别调整胸腺细胞悬液浓度为1×107/ml，脾细胞悬液浓度为1×107/ml和5×106/ml备用。1.2.3T淋巴细胞亚群测定动态观察子代大鼠在出生2周、7周时胸腺中淋巴细胞亚群表达情况，随机取实验组及对照组子代大鼠各20只，各个时期分别取10只进行观察，按上(1.1.2)无菌取胸腺，制作细胞悬液。取胸腺细胞悬液(浓度为1×107/ml)1ml用单克隆免疫荧光抗体FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8各10μl标记[9]，混匀，避光室温放置20min后，各取已标抗的胸腺细胞悬液100μl，加入2mlPBS液(pH：7.4)混匀，室温放置10min后，1000r/min离心5min，去上悬液，加入0.5ml1%多聚甲醛固定液固定，流式细胞仪检测,并计算其百分比及CD4/CD8比值。1.2.4NK细胞表面标志CD161测定观察对象及时机同上，按上(1.1.2)无菌取脾，制作细胞悬液。参照[9]取脾细胞悬液(浓度为1×107/ml)1ml，用单克隆免疫荧光抗体FITC-CD161标记[10],混匀，避光室温放置20min后，取已标抗的脾细胞悬液100μl，加入红细胞裂解液2ml，室温放置10min，1000r/min离心5min，去上悬液，加入0.5ml1%多聚甲醛固定液固定，流式细胞仪检测，并计算其百分比。1.2.5T淋巴细胞增殖转化功能测定(CCK-8法)子代大鼠出生7周左右，取实验组及对照组子代大鼠各10只进行实验观察，按上(1.1.2)无菌取脾，制作细胞悬液。参照[9][11]取脾细胞悬液4ml，离心清洗3次(1500r/min12min)，最后用含10%新生小牛血清的IMDM液调整浓度为5×106/ml，分别加入96孔细胞培养板中，每孔加100μl细胞悬液，观察T淋巴细胞增殖转化组每孔加PHA(每孔终浓度为5μg/ml)100μl，空白对照组每孔加IMDM液100μl。放置37℃5%的CO2培养箱中培养72h，在终止培养前6h掺入CCK-8(CCK-8法实验原理类似于XTT法及MTT法)，每孔10μlCCK-8，继续培养6h后取出，在酶标仪450mm处测定D(λ)值。1.2.6B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白(IgM、IgG)定量检测子代大鼠出生7周左右，取实验组及对照组各子代大鼠10只进行实验观察，心脏取血后离心留取上清液。按照血清免疫球蛋白定量检测ELISA试剂盒的步骤进行检测并记录结果。1.2.7统计学处理所有数据均经SPSS10.0进行统计学处理，计量资料均用均数±标准差表示，采用t检验方法。2结果2.1体质量及脏器重量动态观察子代大鼠在各个时期(出生1～2周、5周、6周)的发育情况，随机取实验组及对照组子代大鼠各40只，各个时期分别取10只进行观察，结果显示：(1)子代大鼠出生体质量及出生数目：实验组的子代大鼠出生数目及出生体质量与对照组的子代大鼠相比较，明显较对照组要低，存在统计学差异(t=5.00，P≤0.01；t=-2.18，P≤0.05)。(2)实验组子代