土壤微生物多样性研究方法

应用生态学报2004年5月第15卷第5期CHINESEJOURNALOFAPPLIEDECOLOGY,May2004,15(5)∶899～904土壤微生物多样性研究方法31,2331钟文辉蔡祖聪(1中国科学院南京土壤研究所,南京210008;2南京师范大学化学与环境科学学院,南京210097)【摘要】概述了研究土壤微生物多样性的主要方法.传统上,土壤微生物群落的分析依赖于培养技术,使用各种培养基最大限度地培养各种微生物群体,但仍只能培养和分离出一小部分土壤微生物群落.使用Biolog分析、磷脂脂肪酸分析和核酸分析等方法,可研究和表征那些现在还不能够被培养的土壤微生物,从而获取关于土壤微生物群落多样性的更多和更完整的信息.关键词土壤微生物多样性Biolog磷脂脂肪酸核酸分析文章编号1001-9332(2004)05-0899-06中图分类号S15413文献标识码AMethodsforstudyingsoilmicrobialdiversity.ZHONGWenhui1,2,CAIZucong1(1InstituteofSoilScience,Chi2neseAcademyofScience,Nanjing210008,China;2CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing210097,China).2Chin.J.Appl.Ecol.,2004,15(5):899～904.Thispapergaveareviewonthemainmethodsforstudyingsoilmicrobialdiversity.Traditionally,theanalysisofsoilmicrobialcommunitiesreliedonculturingtechniques,usingavarietyofculturemedia.However,onlyasmallfractionofthesoilmicrobialcommunityhasbeenculturedandisolatedwiththisapproach.OthermethodssuchasBiologGNanalysis,phospholipidsfattyacidsanalysisandnucleicacid2basedanalysiscanbeusedtostudyandcharacterizesoilmicrobeswhichcurrentlycannotbecultured,andtogetmoreandcompleteinformationaboutsoilmicrobialcommunity.KeywordsSoil,Microbialdiversity,Biolog,FLFA,Nucleicacid2basedanalysis.平板上的微生物群落的组成.在后一种情况下,需从琼脂平1引言生物多样性包括物种多样性、遗传(基因)多样性和生态系统多样性.土壤微生物多样性包括在栖息地中微生物分类群的多样性和在微生物分类群内的遗传多样性,以及包括群落结构的变异性、相互作用的复杂性、营养水平(tropiclevel)和共位群(guild)数量(功能多样性)在内的生态多样性.其中遗传多样性可认为是遗传信息在微生物聚集地或群落中的量和分布,反映微生物群落中总的遗传潜力.功能多样性则是指发生在一个群落中的碳源利用模式或作用过程数[33].土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类:一类是用于分析土壤中可培养的微生物群落;另一类是用于分析土壤的整个微生物群落.第一类分析方法基于微生物分离菌(isolates)的形态判别、微生物分离菌在BiologGN微滴定板中的反应和微生物分离菌的脂肪酸甲酯谱(FAMEprofiles)等.后一类分析方法不需要培养微生物,包括群落水平的生理特性(CLPP)分析(如在BiologGN微滴定板中的反应分析)、磷脂脂肪酸(phospholipidfattyacids,PLFA)方法和核酸分析(nucleicacid2basedanalysis)方法等.2琼脂培养基培养方法板上将菌落分离出来,并对分离菌进行鉴定.由所得到的分类组或分类群的分布情况可了解群落的结构.培养基的成份影响微生物的生长状况,故培养基的选择可强烈影响所得菌落的多样性[34,64].菌落形成单位(CFU)的数量通常随培养基营养浓度的降低而增加[40,49].然而,只有一小部分土壤微生物群落可用这种方法得到.F·gri等[16]用荧光显微镜检术检出的细菌数比用培养基培养得到的细菌数提高100～1000倍.根据Amann等[3]的评估,大约80%～99%的微生物种不可培养或未能得到培养,说明大部分微生物的特征不能用传统的琼脂培养基平板培养技术来描述.此外,琼脂培养基培养方法需要使用包括分子生物学手段在内的分析技术,才能完成对微生物种的鉴定,分析工作烦琐,工作量大.由于以上局限性,在出现新的评价微生物多样性的方法,特别是分子方法以后,该传统方法已逐渐失宠.3BiologGN方法BiologGN分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法.它是基于微生物利用碳源能力的不同,利用BiologGN系统来研究微生物的碳源利用模式的方法.BiologGN微滴定板的每一个孔中含有一种不同的碳源(共95种)、其它营这是用于估计微生物多样性的传统方法.琼脂培养基培国家杰出青年基金资助项目(40125004).养方法是在琼脂培养基平板上接种培养,可作以下用途:跟33通讯联系人.踪特定分类组(group)或功能组的微生物数量,并评价在该2002-02-20收稿,2003-07-15接受.3900应用生态学报15卷养物和四氮唑染料.接种微生物悬浮物于微滴定板孔中后,将滴定板保温一段合适的时间,通过测定伴随的四氮唑染料的还原,而定期监测底物的氧化.BiologGN微滴定板原来用作对细菌分离菌进行分类[6].然而,这种方法现已被改进,用于表征土壤微生物群落的功能潜力,即被用于估计诸如碳源利用模式等功能多样性[21].BiologGN分析方法当作此用途时,接种物是来自土壤微生物群落的混合物(而不是纯培养),所得结果采用一定的统计方法进行分析.采用该方法时接种量和培养时间很重要.研究表明,底物的氧化取决于所用接种物的组成和密度[20,23,77].另外,被接种的微生物的生理状态可能影响底物利用的动力学和模式[35].在测定过程中,微生物只在含有适合其利用碳源的孔中生长[21,23,77].因此,所观察到的底物利用模式可能只反映了那些在BiologGN微滴定板孔中能够生长的微生物的功能特性,且很可能不是所有的微生物都对Biolog反应特征有贡献[23,28].所得到的碳源利用模式也不一定反映接种的微生物群落中数量上占优势的成员的功能潜力[62].该方法已用于了解土壤[23,41,77]和根际[20]中微生物群落间的差异,也有的研究者用它确定非土著微生物或转基因植物对土壤[13,75]、植物凋落物[32,52]、根际[28]和叶际[28]微生物群落的影响.BiologGN方法具有快速而可再现的特点.然而,该方法对快速生长和适合在实验条件下生长的小部分群落成员有强烈的选择性[62],故与从琼脂平板分离微生物的传统方法有同样的局限性;另一缺点是被测试的底物不能准确地代表出现于生态系统中的底物类型.因此,Biolog反应特征只能粗略地代表实际土壤微生物群体底物利用的动力学特征.4磷脂脂肪酸方法411PLFA在微生物中的分布磷脂脂肪酸谱(PLFAprofile)常被用于研究复杂群落中微生物的多样性[54,79].磷脂是所有生活细胞的细胞膜的基本组分.PLFA是磷脂的组分,具有结构多样性和高的生物学特异性,是特别有效的生物标记物,可用于了解微生物群落结构.总PLFA谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的[74],且在大多数情况下PLFA的某专一类型在某一土壤微生物分类群中占优势.至今,已经积累了大量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据.PLFA或酯链PLFA(EL2PLFA)的总量已被用作土壤样品中微生物生物量的指示物(indicator)[80].细菌含有在其它生物中常见的直链脂肪酸,如油酸或顺型异油酸[十八碳2112稀酸(顺),简写为18∶1ω7或18∶1ω7c]等单不饱和脂肪酸(MUFA).然而,细菌独特的脂肪酸是具分枝链、环丙基和β2羟基脂肪酸.这些脂肪酸在其它生物体中不普遍存在[38].支链脂肪酸主要发现于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性的硫酸盐还原菌、Cytophaga和黄杆菌属[24],而环丙基脂肪酸常见于革兰氏阴性菌株以及革兰氏阳性厌氧菌株[57].MUFA特别是18∶1ω7具有厌氧2去饱和酶途径的真细菌特征,很多这种细菌是革兰氏阴性菌[79].虽然MUFA可出现在革兰氏阳性和阴性细菌中,但在革兰氏阳性细菌中它们对总PLFA的相对贡献很少(20%),故MUFA可用作革兰氏阴性细菌的通用生物标记[57].多不饱和脂肪酸(PUFA)被认为是真核生物的特征性脂肪酸.亚油酸(十八碳29,122二稀酸(顺,顺),简写为18∶2ω6)可作为真菌的一个通用生物标记.但Sundh等[66]推断,这种脂肪酸可能不是对每一生态系统都合适的生物标记,可能只在植物细胞不存在的生态系统中是真菌的较好标记.非酯链未取代脂肪酸(non2ester2linkedunsubstantiatedFA,NEL2UNSFA)是鞘脂和缩醛磷脂的组分.鞘脂已发现存在于拟杆菌属/黄杆菌属[60].近来也发现革兰氏阴性多聚氯酚降解细菌(被鉴定为Sphingomonas属)含有鞘脂[46].缩醛磷脂主要存在于梭状芽孢杆菌属等厌氧细菌中[74],只有很少数的好氧和兼性厌氧细菌含有缩醛磷脂[79].真菌菌丝中已被检测出存在长链非酯链羟基取代脂肪酸(non2ester2linkedhydroxylsubstitutedFA,NEL2HYFA)[75].在脂肪酸第10位碳原子处甲基分枝是放线菌所特有的[37].表征几大类微生物的重要脂肪酸见表1.表1表征微生物的PLFA[29,32]Table1PLFAsignaturesofmicrobes微生物类型Microbialgroup磷脂脂肪酸标记Phospholipidsfattyacidsignatures细菌Bacteriaingeneral含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸(如15∶0、i15∶0、a15∶0、16∶0、i16∶0、16∶1ω5、16∶1ω9、16∶1ω7t、17∶0、i17∶0、a17∶0、cy17∶0、18∶1ω5、18∶1ω7、18∶1ω7t、i19∶0,a19∶0和2cy19∶0等)Containsaturatedormonounsaturatedfattyacidsesterlinkedtoglycerol含有多种分枝脂肪酸Containmorebranchedfattyacids革兰氏阳性细菌Grampositivebacteria22含有多种羟基脂肪酸Containmorehydroxylatedfattyacids;MUFA革兰氏阴性细菌Gramnegativebacteria厌氧细菌Anaerobescy17∶0,cy19∶0好氧细菌Aerobes16∶1ω7、16∶1ω7t、18∶1ω7t硫酸盐还原细菌Sulfatereducingbacteria10Me16∶0、i17∶1ω7、17∶1ω622甲烷氧化细菌Methaneoxidizingbacteria16∶1ω8c,16∶1ω8t,16∶1ω5c,18∶1ω8c,18∶1ω8t,18∶1ω6c嗜压/嗜冷细菌Barophilic/psychrophilicbacteria20∶5,22∶6黄杆菌Flavbacteriumbalustinumi17∶1ω7,Br2OH15∶0芽孢杆菌Bacillusspp1各种