在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化

中国组织工程研究第20卷第14期2016–04–01出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchApril1,2016Vol.20,No.14ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2117·研究原著·李平，男，1970年生，云南省昆明市人，汉族，1995年昆明医学院毕业，副主任医师，主要从事肾脏研究。通讯作者：皇甫春荣，主治医师，云南省第一人民医院，云南省昆明市650032中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)14-02117-06稿件接受：2016-02-12杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化李平，皇甫春荣，汤春辉，陈一晖(云南省第一人民医院，云南省昆明市650032)引用本文：李平，皇甫春荣，汤春辉，陈一晖.在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化[J].中国组织工程研究，2016，20(14):2117-2122.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.021ORCID:0000-0002-0971-6000(李平)文章快速阅读：文题释义：成体干细胞：成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能多能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。人脐带间充质干细胞：是一类特殊的细胞，具备自我更新和自我增殖能力，能向心肌样细胞分化潜力，从而形成肌细胞，能够作为组织工程等领域重要的种子细胞之一。人脐带间充质干细胞具备较强的增殖能力，分离的细胞具备充质干细胞的基本生物学特性，能够在5-杂氮胞苷诱导下分化为心肌样细胞，并且该细胞能够作为心肌样细胞移植的重要来源，具有较高的临床应用价值。摘要背景：人脐带间充质干细胞属于一类特殊的干细胞，该类细胞数量有限，且分离、纯化难度系数较大，并且临床上对于该类细胞生物学特性缺乏认识。目的：研究人脐带间充质干细胞的生物活性特性，探讨人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用。方法：无菌采集剖宫产新生儿脐带，在胶原酶Ⅱ下进行消化，采用组织块培养法分离人间充质干细胞。利用免疫细胞化学染色检测细胞表面标志，观察细胞形态学特性，并采用MTT法检测细胞增殖绘制其生长曲线，将获得的人脐带间充质干细胞进行培养，待细胞生长到70%-80%融合时，采用10μmol/L5-杂氮胞苷进行24h诱导。结果与结论：①组织块贴壁法培养1周后：可见人脐带间充质干细胞，去组织块加入培养液培养后，人脐带间充质干细胞集落生长；②第3代及第10代人脐带间充质干细胞接种24h内：细胞为潜伏期，此后呈对数生长，倍增时间为30h；③免疫细胞化学染色结果显示：第3代细胞90%以上表达基质细胞相关表面标志物CD44、CD29等，不表达造血及内皮细胞标志物CD28、CD31；④人脐带间充质干细胞诱导3周后：细胞突起消失，出现不规则形状，诱导4周后呈现圆形，且表达心肌特异性免疫标志物。⑤结果提示人脐带间充质干细胞具备较强的增殖能力：分离的细胞具备充质干细胞的基本生物学特性，能够在5-杂氮胞苷诱导下分化为心肌样细胞。人脐带间充质干细胞的生物学特性检测过程新生儿脐带组织块培养法人间充质干细胞免疫细胞化学染色检测：细胞表面标志倒置显微镜观察：细胞形态MTT法检测：细胞增殖加入5-杂氮胞苷诱导：其向心肌样细胞分化的效果李平，等.在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化P.O.Box10002,Shenyang110180’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,YunnanProvince,ChinaCorrespondingauthor:HuangpuChun-rong,Attendingphysician,FirstPeople’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,YunnanProvince,China关键词：干细胞；分化；人脐带间充质干细胞；心肌样细胞；组织块培养法；MTT；生长曲线；心肌样细胞；5-杂氮胞苷；云南省自然科学基金主题词：干细胞；成体干细胞；组织工程基金资助：云南省自然科学基金面上项目(2009CD08)Humanumbilicalcordmesenchymalstemcellsinducedby5-azacytidine:bioactivepropertiesandcardiomyocyte-likedifferentiationLiPing,HuangpuChun-rong,TangChun-hui,ChenYi-hui(FirstPeople’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,YunnanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Humanumbilicalcordmesenchymalstemcellsbelongtoaspecialclassofstemcellswithalimitednumber,whicharedifficulttoisolateandpurify.Importantly,thereisalackofclinicalunderstandingofbiologicalcharacteristicsofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells.OBJECTIVE:Tostudythebioactivepropertiesandcardiomyocyte-likedifferentiationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells.METHODS:Underasterilecollection,umbilicalcordbloodofnewbornfromcesareansectionwascollectedtoisolatehumanmesenchymalstemcellsbydigestionusingcollagenaseII.Immunohistochemicalstainingwasusedtodetectcellsurfacemarkersandobservemorphologicalcharacteristics,andMTTassayusedtodetectcellproliferationanddrawcellgrowthcurve.Cellsgrownto70%-80%confluenceweretreatedwith10μmol/L5-azacytidinefor24hours.RESULTSANDCONCLUSION:Oneweekafteradherenttissueculture,humanumbilicalcordmesenchymalstemcellswereseen,andthenthecellsculturedinculturemediumshowedcolonygrowth.Within24hoursofcellseeding,cellsatpassages3and10wereatlatencyperiodandthengrewlogarithmicallywithadoublingtimeof30hours.Immunocytochemicalstainingshowedthatpassage3cellsatover90%confluenceexpressedCD44andCD29,ratherthanCD28andCD31.Threeweeksafterinducedculture,thecellswiththeabsenceofprocessesgrewirregularly;after4weeks,thecellswereroundinshapeandexpressedcardiac-specificimmunemarkers.Takentogether,isolatedhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellswithstrongproliferativeabilityhavethebasicbiologicalcharacteristicsofmesenchymalstemcells,whicharecapableofdifferentiatingintocardiomyocyte-likecellsinducedby5-azacytidine.Subjectheadings:StemCells;AdultStemCells;TissueEngineeringFunding:theNaturalScienceFoundationofYunnanProvince,No.2009CD08Citethisarticle:LiP,HuangpuCR,TangCH,ChenYH.Humanumbilicalcordmesenchymalstemcellsinducedby5-azacytidine:bioactivepropertiesandcardiomyocyte-likedifferentiation.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(14):2117-2122.0引言Introduction间充质干细胞是一类具有显著的自我更新、多向分化能力的细胞，其来源丰富，主要存在于骨髓、脂肪、胎盘以及其他器官间质内，具有自我更新及增殖能力，并且能够在一定的条件下诱导为骨细胞、心肌样细胞等，是组织工程领域比较重要的种子细胞之一[1]。脐带作为分娩弃物，其来源相对广泛，取材方便。研究显示脐带中富含间充质干细胞，容易获得，分离成功率较高，具有多项分化能力。而人脐带间充质干细胞容易分离、培养，体外增殖能力较强，能运用于干细胞移植治疗人类疾病，且不会存在组织配型、医学伦理及免疫排斥等问题，成为组织工程以及再生医学领域使用较多的种子细胞。同时，人脐带间充质干细胞能在机体内长期传代并保持其原有的干细胞表型和分化特性，但是临床上对于该特性尚存在较大的争议[2]。心血管疾病类型较多，包括高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、动脉粥样硬化等，患者发病后如果得不到及时有效的治疗，将会诱发其他疾病，严重者将威胁患者生命。常规治疗方法以药物、介入或手术治疗为主，这些方法虽然能延长患者生存期，但医疗费用较高，患者治疗后并发症发生率较高，难以在临床上推广应用。随着组织工程学的不断发展，细胞移植在心血管疾病中李平，等.在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2119得到应用，而心肌样细胞移植作为一种全新的治疗方法，能有效的改善患者治疗预后，促进患者早期恢复[3-4]。为了使人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化，多数学者采用5-杂氮胞苷作为诱导剂进行心肌样细胞特异性标志物的表达，结果显示，干细胞能在特定环境下向心肌样细胞分化，能为心血管疾病的治疗提供依据和参考[5-6]。因此作者拟对人脐带间充质干细胞的生物活性及分化的心肌样细胞的效果进行分析。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照细胞学研究。1.2