在体小肠吸收实验

在体小肠吸收实验【实验目的】1.掌握大鼠在体肠管泵循环法研究吸收的试验方法。2.掌握药物肠管吸收的机理和计算吸收速度常数（ka）和吸收半衰期（t1/2（a））的方法。【实验原理】研究药物消化管吸收试验方法，大致可分为体外试验法、在体试验法和体内试验法等。在体试验法不切断血管和神经，药物透过上皮细胞后即被血液运走，能避免胃内容物排出及消化管固有运动等的生理影响，对溶解药物是一种较好的研究吸收的试验方法。但本法只限于溶解状态药物，并有可能将其它因素引起的药物浓度的变化误作为吸收。消化管吸收药物主要方式是被动扩散。药物服用后，胃肠液中高浓度的药物向低浓度的细胞内透过，又以相似的方式扩散转运到血液中。这种形式的吸收不消耗能量，其透过速度与膜两侧的浓度差成正比，可用下式表示：−𝑑𝑄𝑑𝑡=𝐷𝐾𝑆𝐶−𝐶𝑏ℎ式中D为药物在膜内的扩散系数；k为药物在膜/水溶液中的分配系数；C为消化管内药物浓度；Cb为血液中药物浓度；h为膜的厚度。令Dk=P，P为透过常数一般药物进入循环系统后立即转运全身，故药物在吸收部位循环液中的浓度相当低，与胃肠液中药物浓度相比，可忽略不计。若设PS/h=k’，式（1）可简化为：−=𝑆=式（2）说明药物透过速度属于表观一级速度过程。以消化液中药物量的变化率dx/dt表示透过速度，则−dXdt=𝐾𝑎𝑋lnX=ln𝑋0−𝐾𝑎以小肠内剩余的药量的对数lnX对取样时间t作图，可得一直线，从直线的斜率可求得吸收速度常数ka，其吸收半衰期t1/2（a）为：1/2=0.693/𝐾𝑎小肠在吸收过程中，不仅吸收药物，也吸收水分，导致供试液体积减少，故不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余药量。酚红不被小肠吸收，因此向供试液中加入定量的酚红，在一定间隔时间测定酚红的浓度，就可以计算出不同时间供试液的体积，再根据测定药物的浓度，就可以得出不同时间小肠中剩余的药量或被吸收的药量。【实验内容与操作】1.试剂的配制（1）0.1%NaNO2溶液：称取NaNO20.1g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。（2）0.5%氨基磺酸铵（NH2SO3NH4）溶液：称取氨基磺酸铵0.5g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。（3）0.1%二盐酸萘基乙二胺溶液：称取二盐酸萘基乙二胺0.1g于100ml容量瓶中，加乙醇适量溶解，并用乙醇定容，摇匀。（以上试剂配好后冰箱保存）（4）1mol/L盐酸：取浓盐酸9ml置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。（5）0.2mol/LNaOH：称取NaOH0.8g，加蒸馏水适量溶解后，转移至100ml容量瓶内定容。（6）生理盐水：称取NaCl0.9g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。（7）Krebs-Ringer试剂（pH7.4）：称取NaCl7.8g，KCl0.35g，CaCl20.37g，NaHCO31.37g，NaH2PO40.32g，MgCl20.02g，葡萄糖1.4g，加蒸馏水适量使成1000ml。（8）1%戊巴比妥钠液：称取戊巴比妥钠1g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀(10mg/ml)。2.供试液与酚红液的配制（1）供试液：精密称取磺胺嘧啶（SD）20mg，酚红20mg置1000ml容量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容，摇匀。（2）酚红液：精密称取酚红20mg置1000ml容量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容，摇匀。3.循环实验的操作（1）蠕动泵流速的调节：插上专用电源线，按下电源开关，选择所需工作的方向；按动快、慢档开关，调节流速为5ml/min和2.5ml/min。（2）恒温水浴调节：将水浴温度调节为37±0.5℃。（3）供试液的准备：取75～80ml供试液加入循环装置的烧瓶中，见图3-1-1，将烧杯置恒温水浴中预热至37±0.5℃。（4）生理盐水的准备：取生理盐水适量，预热至37℃备用。（5）大鼠麻醉：取实验前禁食一夜、体重约为200g的雄性大鼠一只，按40mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，并固定于固定台上。（6）小肠两端插管：沿大鼠腹部中线打开腹腔（约3cm），在十二指肠上部和回肠下部各切一小口，插入直径约0.3cm的玻璃管，并用线扎紧。（7）肠管洗涤：用注射器将37℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗去肠管内容物至净。（8）作成回路：将肠管两端的玻璃管按图3-1-1所示与胶管连接，作成回路，开动蠕动泵，其流速为5ml/min。（9）取样：以5ml/min流速循环10min后，将流速调节为2.5ml/min，立即自供试液烧瓶中取样两份（1ml和0.5ml各一份），分别作为SD和酚红零时间样品，另向烧瓶中补加酚红液2ml，其后每隔15min按同法取样及补加酚红液，共取样9次，停止循环。4.含量测定（1）标准曲线的制作1）SD的标准曲线：吸取供试液2、4、6、8、10ml分别置10ml容量瓶中，加蒸馏水定容，再各吸取上液1ml置10ml带塞试管中，加入1mol/L盐酸5ml，摇匀，加0.1%NaNO2溶液1ml，摇匀，放置3min，加0.5%氨基磺酸铵（NH2SO3NH4）溶液1ml，摇匀，放置3min，再加0.1%二盐酸萘基乙二胺溶液2ml，摇匀，放置20min。照分光光度法在550nm的波长处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到SD标准曲线方程。2）酚红的标准曲线：精密称取酚红约25mg置250ml容量瓶中，加蒸馏水定容，再吸取上液1、2、3、4、5、6ml置10ml容量瓶中，加蒸馏水定容，再分别吸取0.5ml置10ml带塞试管中，加0.2mol/LNaOH5ml，摇匀。照分光光度法在555nm的波长处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到酚红标准曲线方程。（2）样品测定1）SD的测定：取样品1ml置10ml带塞试管中，加入1mol/L盐酸5ml，摇匀，以下步骤按SD标准曲线项下操作，在550nm的波长处测定吸收度。2）酚红的测定：取样品0.5ml置10ml带塞试管中，加入0.2mol/LNaOH5ml，摇匀，在555nm的波长处测定吸收度。5.操作注意（1）在大鼠麻醉前应作好一切准备工作。如手术器械、水浴温度的调节，试药配制并放在近处，蠕动泵流速调节等。如果蠕动泵上并未标出流速，可用量筒接流出液（蒸馏水）的方式确定流速。（2）由于小肠很细，小肠两端插上玻璃管后再洗涤非常容易堵塞，防止的方法是先将十二指肠端插上玻璃管，回肠端找好后先用线扎紧（为以后找切口位置），然后在扎线处切个小口。生理盐水（37℃）从十二指肠端插管处注入，洗涤内容物至净，再在回肠端切口处插上玻璃管。（3）插玻璃管时应注意方向，在十二指肠端向下插，回肠端向上插，以构成回路。（4）SD的测定中，加入氨基磺酸铵后要充分振摇至无气泡发生。（5）SD比色测定空白液的制法：取酚红液1ml置10ml带塞试管中，加1mol/LHCl5ml，摇匀，以下操作按SD标准曲线制作。（6）酚红比色测定的空白液为0.2mol/LNaOH。【实验结果与讨论】1.分别写出SD和酚红的标准曲线回归方程和相关系数。SD标准曲线：y=0.0210x-0.0332(R^2=0.9981)酚红标准曲线:y=0.0153x-0.0082(R^2=0.9973)2.SD和酚红样品浓度的计算根据SD和酚红的标准曲线方程，分别计算出不同时间SD和酚红样品的浓度，并填于下表。3.不同时间SD剩余量的计算按上表中公式计算出不同时间的剩余药量，并求得剩余药量的对数值。如上图所示4.ka和t1/2（a）的计算以剩余药量的对数对相应的时间作图，可得一条直线，由直线的斜率求出ka，并计算得t1/2（a）。取样时间/minSD吸光度浓度（ug/mL）酚红吸光度浓度（ug/mL）供试液体积/mL剩余药量/mglnX循环前/20.0/20.080.01.600.47000.37819.60.34522.072.71.420.353150.33717.60.33821.674.61.340.295300.31516.60.35022.372.31.250.227450.30015.90.34922.372.81.240.211600.28915.30.35622.771.61.200.185750.26514.20.35022.373.11.170.153表1.SD大鼠在体肠吸收实验数据表Ka=0.0026t1/2=0.693/Ka=266.54min5.每小时吸收率计算每小时吸收率（%）=（零时间剩余药量-1h的剩余药量）/零时间剩余药量*100%=15.49%【思考题】1.在体吸收试验法的特点是什么？在体试验法不切断血管和神经,药物透过上皮细胞后即被血液运走,能避免胃内容物排出及消化管固有运动等的生理影响,对溶解药物是一种较好的研究吸收的试验方法.但本法只限于溶解状态药物,并有可能将其它因素引起的药物浓度的变化误作为吸收。2.影响试验结果的主要因素有哪些？肠管回路的连接状况，流动液的温度，大鼠的麻醉情况，SD和酚红的标准曲线的制作，整个实验过程中取样和补液的精密程度等等。3.供试液中为什么要加酚红？小肠在吸收过程中，不仅吸收药物，也吸收水分，导致供试液体积减少，故不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余药量。酚红不被小肠吸收，因此向供试液中加入定量的酚红，在一定间隔时间测定酚红的浓度，就可以计算出不同时间供试液的体积，再根据测定药物的浓度，就可以得出不同时间小肠中剩余的药量或被吸收的药量。y=-0.0026x+0.3334R²=0.94490.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.40001020304050607080ln(X/mg)时间/min图1.SD大鼠在体肠吸收lnX-t曲线