参考实验方案

参考实验方案第一部分：LN-NLC-Ni的制备及评价一、制备将2mgDOGS-NTA-Ni溶于2.2ml甲醇中，得到澄清的溶液，盛放在EP管中待用，按原有处方工艺在西林瓶中制得澄清的油相，将DOGS-NTA-Ni的甲醇溶液加入油相中，稍加热至70℃，再与70℃的水相混合，将混合液小心转入25ml小烧杯中，70℃，乳化40min，以加快乳化过程中甲醇的挥发（在西林瓶中甲醇挥发不完全），制得LN-NLC-Ni。二、评价1.LN-NLC-Ni电位、粒径及其分布的考察2.LN-NLC-Ni包封率及载药量的测定3.红外验证DOGS-NTA-Ni在NLC的表面3.1先将LN-NLC-Ni冷冻干燥成粉末，红外观察DOGS-NTA-Ni和LN-NLC-Ni，看DOGS-NTA-Ni的相关吸收峰是否发生了变化。参考文献如：1760cm-1处是DOGS-NTA-Ni中的羰基；567cm-1是N-Ni键；722cm-1是Ni-O键；1400-800cm-1是DOGS-NTA-Ni其他成分产生。在LN-NLC-Ni中有些吸收峰位置有稍微变化，可能是由于所处环境不同造成。本实验如下图：可证明Ni存在于NLC中3.2为减少其他峰的干扰，需进行空白载体实验，对不加药的NLC-Ni和NLC进行红外分析。第二部分：CPP-LN-NLC-Ni的制备及评价1.制备方案（一）（1）0.5mgCPPs可溶于250μL双蒸水中，浓度为2mg/mL，4℃冷藏，当天使用。（用无菌水溶解时，可置于-20℃冰箱保存几天，在装有新鲜干燥剂的干燥箱内升至室温，大约需要1h左右）。按照CPPs与DOGS-NTA-Ni的质量比分别为1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，取6his-taggedCPPs溶液的量分别为：135μL、200μL、400μL、800μL、1200μL，加至4ml（为了在评价实验中够用，因此取4ml反应）LN-NLC-Ni（含Ni为0.8mg）中，水浴混合，室温下持续搅拌，得到CPP-LN-NLC-Ni。（本实验共需5.47mgCPP）（2）可先参照某个比例来确定搅拌时间。先按0.5:1的比例进行反应，在搅拌时间分别为30min、1h、2h、4h时取样进行评价试验（一次取4ml进行评价，取四次，为了有足够的量进行评价，制得LN-NLC-Ni的制剂总量是否要改为20ml（含Ni的量4mg，需用CPP的量2mg）？只进行透皮实验进行评价，看搅拌时间是否影响渗透效果），根据结果确定搅拌时间。（3）查阅文献得出搅拌速度影响不大，有的甚至并没有搅拌，因此没有考察搅拌速度（只要有一定的搅拌，使其充分反应即可）。此方案如何看是否充分反应，直接通过透皮实验来看。2.评价本制备方法中，对处方及工艺的筛选通过粒径、电位、包封率、体外经皮渗透实验（主要）来评价。（0.5ml+1ml+1ml+1ml=3.5ml）1.制备方案（二）：通过细胞对制剂的摄取效果来确定CPP的用量以及Ni在连接中的作用。1.1荧光探针DID（或FITC）标记NLC（空白）初定将0.1mg荧光染料溶于一定体积甲醇中（将其溶解），加入制得的NLC（无药的空白NLC）中，得FNLC。（参考文献：DID荧光探针的用量为制剂总量的0.001%，因此，需0.1mg荧光探针加入10mL制剂中）1.1.1荧光探针DID（或FITC）标记NLC-Ni1.1.2荧光探针DID（或FITC）标记NLC（无Ni）作为对照制备不加Ni的CPP-NLC在细胞摄取实验中做为对照，根据细胞对CPP-NLC-Ni和CPP-NLC（无Ni）的摄取情况的不同，表现为流式细胞仪测得的细胞内的荧光强度的不同，可得出Ni在CPP与NLC连接中的重要作用。1.2CPP-FNLC的制备将100μLFNLC与10μg，20μg，40μgCPP（参考文献中CPP：Ni=0.5:1，1:1，2:1）室温下反应1h，即得CPP-NLC。1.3细胞培养（培养某肿瘤细胞即可，主要研究CPP穿过细胞膜的能力）参考文献如：1.3.1细胞复苏(1)细胞从液氮中取出立即投入到37℃水浴中。(2)用枪吸取细胞至装有培养基（RPMI）的10mL离心管中，吹打几下，离心管1200r离心4min。(3)离心期间取3.0-4.0mL培养基至小培养瓶(培养皿)中。(4)倒去上清液，加3.0mL培养基，移液枪反复吹打几遍，枪吸取细胞置培养皿中，前后晃动，使细胞充分接触瓶壁。标记好日期、细胞种类、培养基pH值等。观察细胞形态(圆整独立)，喷洒酒精放入细胞培养箱中，在培养箱中将瓶盖拧松至用手稍碰瓶盖即能转动，左右轻晃几次。细胞充分贴壁后，更换培养基。1.3.2细胞传代(1)培养瓶中的细胞覆盖率达到80％时要传代。(2)把原有培养基倒掉，加4mLPBS涮洗，瓶子放平，前后均匀晃动，倒掉。(3)加入4mL胰蛋白酶，细胞瓶平放消化1.2分钟，置离心管中放置。(4)平拿培养瓶前后轻晃，用弯头滴管加入4mL含血清的培养基终止消化。(5)弯头滴管轻轻取液．放液重复吹打，使壁上细胞脱落下来，1000rpm离心4分钟。(6)离心好的细胞倒掉上清液，加0.5mL无血清细胞冻存培养基，并补充10%的胎牛血清和抗生素，移液枪吹打混匀。(7)将细胞按比例传到几个培养瓶中，拧紧盖。显微镜下观察，若有细胞粘连，需继续吹打或轻晃几下，直至单个细胞均匀的混悬在培养基中。标记细胞种类，日期，培养基pH值。(8)将新培养瓶放入培养箱，拧松盖，培养瓶水平放置轻晃几下，继续培养。1.3.3细胞铺板将细胞置于24孔板中，每孔1×105个细胞，在滴加时要不断摇晃母液，且从孔中间滴加，滴完之后向孔四周轻吹打细胞，轻轻晃动混匀。1.4流式细胞分析1.4.1制剂与细胞共同培养(1)将培养的细胞用PBS轻冲洗3遍，在孔板中加入CPP-FNLC、FNLC制剂0.1mL，在4℃孵育1h。(2)用PBS润洗1遍板孔，用胰蛋白酶消化细胞，适量培养基终止消化，1000rpm离心4min，倾去上清液，加入预冷的含肝素PBS(1mg／mL)吹散，离心洗涤二次后，加入400μLPBS制成细胞悬液，用细胞过滤至流式管中，备流式细胞分析用。以细胞内的荧光强度为评价指标进行分析，可筛选出CPP的合适用量。3.制得的CPP-NLC的最终评价（与修饰前相比较）3.1粒径及其分布3.2电位3.3包封率3.4TEM观察形态参考文献如：未连CPP的脂质体(A)和连有CPP的脂质体(B，C，D)的透射电镜图片：可以看到加了CPP的脂质体，在脂质体的表面有肽的聚集（文献中对B、C、D之间的区别没有作任何解释）。3.5CPP-LN-NLC-Ni初步稳定性考察将CPP-LN-NLC-Ni分别放置于（41）℃冰箱，室温（251）℃，（391）℃恒温箱放置1个月，每隔一周取出适量样品测定其粒径、电位、包封率，记录数据。3.6体外释放试验3.6.1方法参考一：分别精密量取1mLCPP-LN-NLC-Ni、LN-NLC-Ni以及LN-NLC分散液（含LN浓度已知），置于截留分子量为10000的透析袋中，密封两端，其中一端固定在溶出仪的搅拌桨下端，溶出介质为含0.1％吐温80的pH7.4磷酸盐缓冲液，介质体积20mL，水浴温度(37+0．5)℃，搅拌转速400r·min-1。分别在溶出的0.5，l，2，4，8，10，12，18，24h，取释放液1mL（立即补加等量的新鲜接收介质）过0.22μm微孔滤膜，取续滤液进样检测，根据结果绘制体外释放曲线并分析药物释放情况。参考二：体外释放试验在Franz扩散池中进行，将10000（分子截留量）的多孔膜放置在供给池与接收池之间，将1mlNLC分散液均匀涂在膜表面，接收池中的接受介质为PH7.4的PBS+0.5%的乳化剂，体积为16mL，300rpm，32℃，在预设时间点1,2,4,6,8,12,24h取全部接收液（并立即补加等量新鲜接收液）过0.22μm微孔滤膜，取续滤液进样检测，根据结果绘制体外释放曲线并分析药物释放情况。3.6.2条件3.6.2.1滤膜或透析袋的分子截留量的选择初定透析袋的截留分子量为10000（同文献中，参考测包封率时，超滤管的滤膜大小）（在参考文献中，进行塞来昔布（MW为381.37）的NLC体外释放时，用的是6000-8000分子截留的纤维素膜）3.6.2.2释放介质（7）体外经皮渗透试验（参考老师文章）离体鼠皮的制备取健康雄性昆明小白鼠(体重18-22g)，颈部脱臼处死，仔细剔除腹部皮肤上的毛后，剥离腹部皮肤，小心剔除皮下脂肪和粘连物后用PH7.40的磷酸盐缓冲液冲洗干净，检查皮肤的完整性，置于密封袋中，-20℃冰箱中冷冻保存，于1周内使用。体外经皮渗透试验采用Franz扩散池在（371）℃下进行对CPP-LN-NLC-Ni、LN-NLC-Ni、LN-NLC及LN进行透皮实验。将制备好的小鼠皮肤加在扩散池的两个半池之间，角质层面向供给池，扩散池扩散面积A为1.77cm2，在两个半池中分别加入PH7.40的磷酸盐缓冲液浸没鼠皮，接受池体积为16mL，放入智能透皮试验仪中(电磁搅拌器以400r．min-1的速度进行搅拌)平衡1h后，抽出供给池侧的磷酸盐缓冲液，取各种样品1mL均匀涂布在皮肤的角质层上，用封口膜密封供给池开口和取样口，于给药后第1，2,3,4,6,9,12和24h抽取全部接受液，经适当稀释后0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液用HPLC测定，同时补加等量同等温度的新鲜接受液。接受池中的单位面积累积渗透量按下式计算：24,1nVAPnQni其中，Pn为第n个取样点测的药物浓度（μg/mL）；V为取样体积即接受池体积（mL）；A为渗透面积（cm2）；以单位面积累积渗透量Q为纵坐标，时间t为横坐标作图，可得到累积渗透曲线，求其斜率即为稳态透皮速率J（μg.cm-2.h-1）皮肤样品中药物的提取在体外经皮渗透实验结束后，取下鼠皮，用PH7.40磷酸盐缓冲液冲洗皮肤表面残留的LN制剂，再用滤纸吸干皮肤上的水分后，沿与药物接触的皮肤边缘剪下，将皮肤剪碎后称重，置离心管中，加入0.4mLpH7.40的磷酸盐缓冲液和0.5mL甲醇后，用超声波细胞粉碎机超声6min，用0.1mL甲醇冲洗探头合并洗液与离心管中，14000r·min-1离心10min，倾出上清液。于残渣中入0.5mL甲醇，涡旋混合5min，同样条件离心，倾出上清液，于残渣中再加入0.5mL甲醇，重复同样操作，合并上清液经适当稀释后用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液用HPLC测定，计算单位面积皮肤滞留量Qs(μg·cm-2)。（7）体外共聚焦显微镜观察经皮渗透效果经皮渗透实验完成后，用穿孔器取下给药区域，用胶带移去角质层，共收集十条胶带；下面的组织在-60℃冷冻，放在两个盖玻片之间，对齐（alignitflat），用低温切片机切片，冷冻水平切片（frozenforhorizontalsectioning），得到4个25μm的切片，代表表皮层，剩下的为真皮层，对皮肤切片进行共聚焦显微镜观察。