参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定

1参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（—D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高,约为蔗糖1.36～1.60倍,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。（本实验以酵母为原料）一、教学目的通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、过程和方法。本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。二、教学内容2实验设计：包括讲课，答疑，文献综述6学时实验一酵母细胞破碎与蔗糖酶提取条件的选择8学时实验二蔗糖酶的盐析曲线的制作与沉淀分离8学时实验三蔗糖酶的有机溶剂沉淀曲线的制作与沉淀分离8学时实验四蔗糖酶的DEAE-纤维素柱层析纯化8学时实验五蔗糖酶的SephadexG-150柱层析纯化8学时实验六蔗糖酶溶液的冷冻干燥2学时实验七蔗糖酶的纯度分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳8学时实验八蔗糖酶的理化性质研究8学时三、实验设计与研究1器材与方法1.1主要单元操作技术与设备1.1.2单元操作技术细胞组织破碎术、离心分离技术、双水相萃取技术、离子交换层析技术、凝胶层析技术、超滤技术、冷冻干燥技术、分光光度技术、电泳技术等生物分离与检测技术；1.1.2主要设备烘箱、恒温摇床、真空干燥箱、分析天平、电子台秤、超声波细胞破碎仪、粉碎机、超滤器（500ml～5000ml）、冷冻离心机（8000-10000r/min，50ml×6；250ml×6）、普通离心机（5000r/min，200ml×4）、台式离心机（16000r/min,5ml×6）冷冻干燥机、-80度冰箱、制冰机、酸度计、电热恒温水浴锅、匀浆机、蛋白质色谱分离系统（核酸蛋白检测仪、部分收集器、蠕动泵、梯度混合器、φ10-25mm,h300-700mm层析柱）电泳仪及垂直板电泳槽、脱色摇床、紫外-可见光分光光度计、荧光分光光度计、高效液相色谱、气相色谱、凝胶成像系统、250ml和500ml旋转蒸发仪、微量凯氏定氮仪、常量凯氏定氮仪、500-1000W电炉、超声波清洗器、振动混合器、移夜枪（200-5000ul）、层析缸、电吹风等。31.2实验材料与试剂1.2.1酵母菌的扩大培养：采用采用实验室经过筛选诱变获得的酵母菌,增殖培养基：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L和磷酸二氢钾0.1g/L，调节pH为5.0。发酵培养基：葡萄糖12％～15％、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L和硫酸铵0.5g/L，调节pH为5.0。1.2.2实验试剂甲苯（使用前预冷到0℃以下）；95%乙醇；DEAE-纤维素；SephadexG-150；0.05mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.3；十二烷基硫酸钠(SDS);其余试剂均为国产分析纯。1.2分析方法1.2.1蛋白质浓度的测定：采用Folin法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。1.2.2还原糖的测定：采用DNS法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。1.2.3酶活性测定（参考：徐桦,陆珊华,孙爱民.酵母蔗糖酶Km值的测定[J].南京医科大学学报,1999,17(4):329-330）取适当稀释的酶液0.5mL,加入0.3mLpH4.6、0.1mol/L的NaAc-HAc缓冲液,0.2mL0.1mol/L的蔗糖,37℃准确反应15min,后加0.125mL1mol/L的NaOH中止反应。用DNS法在540nm波长下测定形成的还原糖量。在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成还原糖,经DNS测定光吸收读数为1mA所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。1.2.4蔗糖酶的纯度分析：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（试剂方法参考生物化学原理和方法）2酵母蔗糖酶的提取纯化工艺4干酵母酶粉湿酵母粗酶液I水洗细胞破碎离心3000r/min10min离心3000r/min15min粗酶液II沉淀分离离心10000r/min20min纯酶液色谱分离冻干酵母蔗糖酶的提取纯化工艺流程图2.1粗酶制备（蔗糖酶的提取）目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，常用方法有甲苯研磨（自溶）法、冻融研磨法、SDS抽提法等。其中甲苯自溶法耗时长，效率低，目前很少使用。2.1.1甲苯自溶法称取酵母泥50g,加入20mL双蒸水使其溶解,加入5gNaAc和10m甲苯,摇床振荡10min,37℃恒温水浴48h。再加入10mL4mol/L的HAc和15mL双蒸水,调pH至4.5,于4℃、3000r/min离心30min,离心后将中层清液移出即为粗制酶液,4℃保存。2.1.2甲苯研磨法①取50酵母泥（准确称量），加10g石英砂，加蒸馏水20ml，研磨5min,，加20mL甲苯，继续研磨10分钟左右，共3次，使其呈糊状。②将研磨好的内容物转移到50mL离心管中，平衡后以10000rpm离心15分钟。③用吸管小心将离心后的中间水层转移到干净的离心管中，勿带上层甲苯相，然后以10，000rpm离心15分钟。④将3步离心后的上清夜取出，倒入量筒中记录其体积，留下1.5mL作为第一组分粗抽提液以备酶活力测定和蛋白浓度测定。2.1.3冻融研磨法称取酵母泥50g,加入20mL双蒸水,置于预先冷却的研钵中,研磨25min,冰箱中冷冻约15min(以研磨内液面上刚出现冻结为宜),取出再研磨25min,重复以上步骤两次。后置于冰箱中冷冻3h取出,温浴融化,用1mol/L的HAc调pH至5.0,40℃水浴30min,冷却后4℃、10000r/min离心15min,取上清液即为粗制酶液,4℃保存。52.1.4SDS抽提法称取酵母泥50g,加入50mL0.3mmol/L的SDS溶解,40℃水浴10h后取出,4℃、10000r/min离心15min,取上清液即为粗制酶液,4℃保存。2.1.5超声波细胞破碎频率超过15～20kHz的超声波，在较高的输入功率下(100～250W)可破碎细胞。其工作原理是：超声波细胞破碎机由超声波发生器和换能器两个部分组成。超声波发生器(电源)，是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20～25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，振动波通过浸入在样品中的钛合金变幅杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。细胞破碎过程中，用于分析细胞破碎率的检测技术对于细胞破碎效果的评估、破碎工艺的选择、工艺放大和工艺条件优化等起着非常重要的作用。最常用的检测细胞破碎效果的方法是通过显微镜直接观察，如用革兰氏染色法，也可以通过测定核酸与蛋白质的含量判断细胞破碎率。正交试验法是研究与处理多因素试验的—种实验设计方法，它可以利用规格化的正交表通过整体设计、综合比较和统计分析，能在很多的试验条件中选出代表性强的少数条件，并能通过较少次数的试验找到较好的实验条件，即最优或较优的方案。在生产实践和科学研究中对于因素多、周期长、有误差的—类试验问题，正交试验法的效果尤其显著。关于正交实验法的书籍目前比版很多，这里不再叙述。本实验应用正交试验法选择酵母细胞超声破碎的最佳实验条件。本实验要求考察的有三个因素即细胞浓度、超声能量和破碎时间，每个因素有四个位级（或称水平）。现综合成一张因素位级表如下：因素试验号A、细胞浓度B、超声能量(%)C、破碎时间(分钟)13%20%326%40%639%60%9412%80%12如果每个因素各个位级的所有组合都做试验，要做43=64次。为了使试验次数减少而又能得到较好的结果，需要选用合适的正交表。现有正交表L16（45），能安排5个4位级的因素，只需做16次试验。本实验中有3个4位级的因素，所以可以选用此表来安排试验。如果不考虑因素之间的交互作用，进行表头设计时，则把因素A、B、C分别放入正交表L16（45）的第5、2和1列上。62.2沉淀分离2.2.1盐析沉淀盐析曲线的制作：a.取7支干净试管编号1～7，分别加入粗酶液5ml；b.分别向1～5号试管中加入饱和硫酸铵1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，然后再分别加入蒸馏水4ml、3ml、2ml、1ml、0ml；分别向6号、7号试管中加先入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5ml，充分摇晃溶解完全后，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1、1/～7、7/，静置1h以上，对称放入离心机中，10000r/min，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。c.向收集的沉淀加入5ml0.1mol/L（pH7.0）缓冲溶液溶解沉淀物；d.采用Folin法测定各管中蛋白质的浓度，采用DNS测定还原糖。e.以硫酸铵饱和度为横坐标，蛋白质浓度和酶活力的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和酶活力盐析曲线。盐析制备蔗糖酶①根据盐析曲线选择硫酸铵饱和度(30～40%饱和度)去除杂质，选择硫酸铵饱和度(约60%饱和度)沉淀酶蛋白。并计算每升溶液达到30～40%饱和度和60%饱和度所需要的固体硫酸铵的量（g），根据酶蛋白粗提液的体积计算30～40%饱和度和60%饱和度时实际所需要的固体硫酸铵的量（g）。②在酶蛋白粗提液中加入经研细的(NH4)2SO4粉末,使其达到30～40%饱和度,充分溶解后,4℃，10000r/min,离心20min,除去沉淀。收集上清夜。③继续向上清液中加入(NH4)2SO4粉末，使其达到60%饱和度,充分溶解后，4℃，10000r/min,离心20min,弃去上清液，收集沉淀。④-I将沉淀溶于少量缓冲溶液中,充分混均,4℃透析约12h后,进一步纯化。（取5mL用于蛋白含量测定和纯度分析）2.2.2乙醇沉淀7乙醇沉淀曲线的制备：方法同盐析曲线的制作乙醇沉淀：在细胞破碎的粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达30%,4℃放置过夜,4℃，10000r/min离心20min,取上清液,再追加乙醇使其终质量分数达50%。4℃放置1h,4℃、10000r/min离心20min,弃上清液,沉淀用蒸水溶解,4℃保存，必要时透析。（pH值为7.0的0.05mol／LTris-HCl缓冲液）。2.3层析分离2.3.1DEAE-纤维素柱层析DEAE-纤维素(DE52)经常规处理后,装柱(100mm×10mm),用起始缓冲液0.05MTris-HClpH7.3缓冲液平衡,调节流速为每2min1mL,按照3-5%的床体积加样,先用0.05MTris-HCl缓冲液洗脱,然后盐度梯度洗脱,由0.05MTris-HClpH7.3缓冲液到0.1MNaCl的