双水相萃取与应用.

双水相萃取与应用PPT制作陆依雯PPT讲解唐名扬林志坚施立成翁浩杰双水相萃取的历史双水相萃取的工艺流程双水相萃取的基本原理双水相萃取的应用与展望01020304目录CONTENTS双水相萃取的历史197819561896荷兰微生物学家贝杰林克将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象。瑞典隆德大学的阿尔贝特松将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质变性和沉淀的问题。双水相萃取的发展历史德国库拉等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离，为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进。双水相萃取的基本原理萃取液固萃取液液萃取反胶束萃取液膜萃取超临界萃取有机溶剂萃取双水相萃取萃取利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术。液液萃取利用液态的萃取剂处理与之不互溶的双组分或多组分溶液，实现组分分离的传质分离过程，是一种广泛应用的单元操作。双水相萃取利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。传统的萃取剂大多数为有机溶剂。以与水互不相溶的有机溶剂作萃取剂从水相中萃取目的产物，广泛应用于抗生素、有机酸、维生素等发酵产品生产。用于蛋白质、核酸、酶等生物大分子的分离很少成功。现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。一定条件下，水相也可以形成两相甚至多相。所以有可能将生物活性物质(水溶性的酶、蛋白质等)从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。这就促使了能在食品工业、生物学研究和生物工程方面具有广泛应用性的双水相萃取方法的产生。到目前为止，双水相技术几乎在所有的生物物质如：氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等的分离纯化中得到应用，特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离中。A聚丙二醇(PPG)聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚蔗糖(Ficoll)羟丙基葡聚糖聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚乙烯吡咯烷酮B硫酸葡聚糖酸钠羧甲基葡聚糖酸钠聚丙烯乙二醇甲基纤维素C羧甲基葡聚糖酸钠羧甲基纤维素钠盐D聚乙二醇硫酸钾，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，磷酸盐酒石酸钠琥珀酸钠，柠檬酸纳E聚乙二醇葡聚糖乙二醇单丁酯丙醇A,两者均为非离子性聚合物,B,一种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质C,两者均为聚电解质,D,一种聚合物，另一种为盐。E,一种聚合物，另一种为有机小分子几种典型双水相系统形成上相的聚合物形成下相的聚合物双水相系统及成相机理两种水溶性聚合物溶液混合，形成单一相还是两相，主要取决于两种因素：系统熵的增加；分子间的作用力。熵的增加与分子数目有关，而与分子大小无关；分子之间的相互作用力可看作分子中各基团相互作用力之和，随分子量的增加而增加。分子量大的聚合物以摩尔计的相互作用能超过混合熵的增加而起主导作用，进而决定聚合物溶液混合发生的现象。当两种聚合物之间互不相溶而排斥，它们的线团结构无法互相渗透，导致一种分子为同种分子所包围，在达到平衡后，形成了互不相溶的各自富含单一种聚合物的两相。Zaslavsky等人认为，聚合物引起水溶液结构变化是促进相分离的主要原因。X-射线衍射数据表明，无水时葡聚糖（DEX）与聚乙烯醇(PVA)混合物(1:1)并不表现不相溶性。在水溶液中，即使在低浓度（3.5%DEX和2.45%PVA）下也会发生相分离。在水溶液中，聚合物的长链分子通过氢键同周围的水分子发生强烈地相互作用，每一个氧原子结合两个水分子，使溶液中的PEG分子被一层高度有序的水合作用层所包围。葡聚糖虽无与PEG类似的结构，但同样，分子中的羟基通过氢键作用在分子周围形成水分子层。两种聚合物周围形成不同的互不相溶的分子结构造成相分离。这一机理可解释温度、添加无机盐和尿素等对相分离行为的影响。按聚合物对溶剂水性质的影响程度为PEG＞PVA＞PVP＞Ficoll＞DEX，而成相所需聚合物浓度为DEX-PVA＜DEX-PEG＜DEX-PVP＜DEX-Ficoll。综合考虑聚合物的分子量因素，二者的次序十分一致。某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时，也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为“盐析”作用。无机盐和简单的有机盐均可，其成相相对能力与其盐析能力次序基本一致。阴离子作用比阳离子重要，多原子离子比单原子离子更有效，成相浓度低。大而电荷密度低的单原子阴离子容易与PEG分子中的氧偶极子发生作用，成相浓度高，无法使用。但它们可以作为中性盐添加组分加入聚合物/聚合物和聚合物/盐系统中，用于改变分配系数。对于聚合物/盐系统，因盐比葡聚糖便宜得多，使得聚乙二醇(PEG)/盐系统具有工业上应用优势。选择双水相的原则能够获得高的产物回收和生物活性回收，高的分离纯化倍数；系统的物理化学性质有利于大规模的应用，有良好的工艺性能，系统黏度低，相分离快，达到相平衡时间短，工艺参数容易控制，工艺条件可调性范围大；系统经济，成本低，无毒，适合大规模应用。双水相系统相图PEG(%)葡聚糖（%）PEG/葡聚糖系统相图系线双节线临界点相图中TCB连线为一双节线，双节线下方为单相区；双节线上方为两相区。如果系统组成处于该区，如M点时，系统分为两相，而上相和下相的组成分别为通过M点与双节线相交的T和B点相对应的组成。上相主要含有PEG，下相主要含有葡聚糖或盐。两相平衡时，符合杠杆规则。当用υT代表上相体积，υB代表下相体积时，则式中BM为B点到M点的距离，MT为M点到T点的距离。M点向下移动时，系线长度缩短，两相差别减少，到达C点时，系线长度为0，两相间的差别消失而成为一相。因此，C点成为系统的临界点。MTBMvvBTPEG(%)葡聚糖（%）系线双节线临界点分配系数双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同，物质进入双水相体系后，由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用，目标物质在上、下相中的浓度不同，从而达到分离的目的。溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系中服从Nernst分配定律：btCCK其中：K代表分配系数；Ct、Cb分别代表溶质在上相、下相中的浓度。系统固定时，分配系数K为一常数，与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0.01，因此为物质分离提供了可能。不同的系统分配系数差别很大，同时对于同一系统，影响分配系数K的因素也有很多。1聚合物及其分子量的影响不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚丙三醇，这种疏水性的差异对目的产物与相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向，若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。体系的pH值对被萃取物的分配有很大影响，这是由于体系的pH值变化能明显的改变两相的电位差。如体系pH值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。2pH值的影响3离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束，存在一穿过相界面的电势差(Donnan电势)，它是影响荷电大分子如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样，对于粒子迁移也有相似的影响，粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。分配系数对温度的变化不敏感，这是由于成相聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活性收率依然很高，而且室温时粘度较冷却时（4℃）低，有助于相的分离并节省了能源开支。4温度的影响这些参数并不是独立地起作用。所以要预测溶质在双水相系统间的分配系数是困难的。这些系统复杂性表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋白质溶质)结构中构象的变化，能使另一些原子暴露在微环境中。这些事实导致只能用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。萃取率当某一物质A的水溶液，用有机溶剂萃取时，则萃取率E应该等于：00100两相中被萃取物的量有机相中被萃取物的量E萃取率反映了物质被萃取的完全程度。双水相萃取特点双水相萃取与传统的水-有机溶剂萃取时一样的，都是利用物质在两相间的分配系数不同来实现分离的。但是与传统萃取相比，双水相有其独特之处。•两相的溶剂都是水，上相和下相的含水量高达70％～90％(w／w)，不存在有机溶剂残留问题。条件很温和，常温常压操作，不会引起生物活性物质失活或变性。•两相界面张力小，仅为10-6～10-4N／m(普通体系为10-3～10-2N／m)，双水相的两相差别(如密度、折射率)很小，萃取时两相能够高度分散，传质速度快，但也引起乳化现象。•溶剂对目标组分选择性强，大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程简化，易于工业放大和连续操作。•分相时间短，常温常压下自然分相时间一般为5-10min。•目标产物的分配系数一般大于3，大部分情况下目标产物的收率较高。•聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度，以及体系的pH值等多种因素都可以对被萃取物质在两相的分配产生影响，因此可以利用多种手段来使反应达到最佳条件。•该体系可以处理以固体微粒形式出现的样本。因其大多是由一定量的聚乙二醇和盐构成，因此也比较经济。缺点和不足双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助处理方法。成本较高。即使水溶性聚合物和盐能回收再用。选择性较低，分离纯化倍数低，一般只适用于粗分离。双水相萃取的工艺流程双水相萃取的工艺流程主要由三部分组成：目的产物的萃取；PEG的循环；无机盐的循环。以分离细胞中蛋白质为例，其工艺流程图如下：目的产物的萃取目标产物的萃取一般分为两步：第一步原料匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合,然后进入分离器分相。通过选择合适的双水相组成,一般使目标蛋白质分配到上相(PEG相),而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相)。第二步在上相中加入盐,形成新的双水相体系,从而将蛋白质与PEG分离,以利于使用超滤或透析将PEG回收利用和目的产物进一步加工处理。PEG的循环在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：①加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。无机盐的循环将含无机盐相冷却,结晶,然后用离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。双水相连续萃取工艺流程图胞内酶双水相萃取工艺流程图多级萃取柱的结构示意图双水相连续多级萃取柱各种流程图1.出口腔2.搅拌轴3.搅拌叶1.2.定量泵3.搅拌器4.萃取柱4.沉降腔(填充玻璃珠)5.沉降室5.6.流量计和流量阀7.光系统(光监测)6.搅拌室7.不锈钢筛网8.监视器9.记录仪10.样品收集器M-电机双水相萃取的应用与展望提取酶和蛋白质进行萃取性生物转化食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质萃取细胞、细胞器、膜等粒子应用于液-液分配层析(LLPC)双水相在金属离子分离中的应用中草药中有效成分的提取双水相萃取技术越来越受到人们的青睐