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双水相萃取技术的应用研究进展摘要双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视,与传统的萃取及其他分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点,从而使其能广泛应用于生物工程、药物分析和金属分离等方面。目前,双水相萃取技术的研究进展集中表现在:廉价双水相体系的开发、新的双水相体系探索、双水相萃取技术同其他技术集成化、双水相萃取相关理论的进展等方面。本文简单介绍了双水相萃取技术及其原理、特点,综述了双水相体系在生物工程(其中包括萃取分离抗生素、酶、分离提纯蛋白质和萃取其他生物活性物质)、药物分析和金属分离等方面的应用,展望了双水相体系的应用前景。AbstractAqueoustwo-phaseextractiontechnologyhasreceivedmoreandmoreattentionasanewseparationtechnology,andithasuniqueadvantagescomparedwiththetraditionaextractionandotherseparationtechnology,forexample,itsmildoperatingconditions,largetreatmentcapacity,easyandcontinuousoperation,andsoon.So,itwaswidelyusedinbiologicaengineering,druganalysisandmetalseparation,etc.Atpresent,theprogressoftheaqueoustwo-phaseextractiontechnologyfocuseson:developmentoflow-costaqueoustwo-phasesystem,explorationofnewaqueoustwo-phasesystem,integrationofaqueoustwo-phaseextractionwithothertechnologies,researchoftherelevanttheoryofaqueoustwo-phaseextraction,andsoon.Thispapersimplyintroducesaqueoustwo-phaseextractiontechnologyanditsprinciple,characteristics,summarizedaqueoustwo-phasesysteminthebiologicalengineering(includingextractantibiotics,extractenzyme,separateandpurifyproteinsandotherbioactivesubstances),druganalysisandmetalseparation,suchasseparationoftheapplication.Thispaperalsoexplorestheprospectoftheapplicationofaqueoustwo-phasesystem.关键词双水相萃取;应用;研究进展1引言双水相萃取与传统的萃取分离技术不同,有其独特的优点,是一种新型的分离技术。因此,双水相萃取获得了较好的成果,受到越来越多研究者的青睐。双水相萃取在诸多方面有着广泛的应用,具有良好的应用前景。2双水相萃取简介2.1双水相体系概述双水相萃取技术(Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE)是指把两种聚合物或一种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起,由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性形成两相[1],是近年来引人注目,极有前途的新型分离技术[。ATPE技术始于20世纪60年代,从1956年瑞典伦德大学Albertsson[4]发现双水相体系到1979年德国国家生物工程研究中心(GBF)的Kula[5]等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离,虽然只有二、三十年的历史,但由于其条件温和、容易放大、可连续操作等特点,目前,已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化,以及生物转化及生物分析中[6]。2.2双水相萃取的原理(1)分配系数双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配[7]。当萃取体系的性质不同,物质进入双水相体系后,由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用,目标物质在上、下相中的浓度不同,从而达到分离的目的。溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系中服从Nernst分配定律:K=Ct/Cb其中:K——分配系数;Ct、Cb——分别代表溶质在上相、下相中的浓度。系统固定时,分配系数K为一常数,与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后,在上相和下相间进行选择性分配,这种分配关系与常规的萃取分配关系相比,表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0.01,因此为物质分离提供了可能[9]。(2)萃取率当某一物质A的水溶液,用有机溶剂萃取时,则萃取率E应该等于:E=有机相中被萃取物的量/两相中被萃取物的量×100%萃取率反应了物质被萃取的完全程度。2.3双水相萃取的特点双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备,并在温和条件下进行简单操作就可获得较高收率和纯度的新型分离技术。与一些传统的分离方法相比,双水相萃取技术具有以下独有的特点:(1)两相间的界面张力小,一般为10-7—10-4mN·m-1(一般体系10-3—2×10-2mN·m-1),因此两相易分散,而且它比一般的有机萃取两相体系界面张力低的多,这样有利于强化相际间的物质传递。(2)操作条件温和,由于双水相的界面张力大大低于有机溶剂与水相之间的界面张力,整个操作过程可以在常温常压下进行,对于生物活性物质的提取来说有助于保持生物活性和强化相际传质。(3)双水相体系中的传质和平衡速度快,回收率高,分相时间短,传质过程和平衡过程速度均很快,自然分相时间一般为5—15min,因此相对于某些分离过程来说,能耗较低,而且可以实现快速的分离。(4)大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其他常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去1—2个分离步骤,使整个分离过程更经济。(5)含水量高,一般为75%—90%,在接近生理环境的体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性。(6)一般不存在有机溶剂的残留问题,现已证明形成双水相的聚合物(如PEG)对人体无害,可用于食品添加剂、注射剂和制药,因此对环境污染小。(7)聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度,以及体系的pH值等因素都对被萃取物质在两相间的分配产生影响,因此可以采用多种手段来提高选择性和回收率。(8)易于连续化操作,设备简单,并且可直接与后续提纯工序相连接,无需进行特殊处理。例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。(9)分配过程因素较多,可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。双水相萃取技术的应用3.1在生物工程中的应用双水相萃取在生物工程中有着广泛的应用,可以萃取分离抗生素、酶、分离提纯蛋白质及萃取其他生物活性物质。(1)萃取分离抗生素朱自强等用8%的PEG2000与20%的(NH4)2SO4组成的双水相体系直接萃取青霉素G发酵液,分配系数高达58.39,浓缩倍数为3.53,回收率为93.67%,青霉素G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13.36和21.9。Su在室温以及pH=10的条件下,利用16.1%的PEG和12%的硫酸盐,0.5mol·L-1高氯酸钠组成的双水相体系成功地从鸡蛋蛋清中分离出高纯度的溶解酵素。(2)萃取分离酶Babu等用18%的PEG1500与14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶,菠萝蛋白的纯化倍数为4.0,酶活性恢复达到22.8%,而多酚氧化酶的纯化倍数为2.07,酶活回收率达到90%。Sarote等利用80%的PEG及15%的(NH4)2SO4组成的双水相体系从木瓜乳浆中萃取出高纯度的木瓜蛋白酶。Mirjana利用PEG4000/Dex体系从Polyporussquamosus发酵液中分离果胶酶,该酶主要分配在上相,酶活回收率80.2%,纯化倍数2.45。Duarte等采用16%的PEG6000和8%的磷酸盐组成的双水相系统从3种不同的微生物中纯化碱性木聚糖酶,净化因子为57,产量为41%。Pan等利用PEG1500/NaH2PO4体系从Trichodermakoningii发酵液中分离纯化U-木糖苷酶,该酶主要分配在下相,下相酶活回收率96.3%,纯化倍数33。Wu等利用PEG8000/(NH4)2SO4体系从Kluyveromycesmarxianus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶,该酶主要分配在上相,酶活回收率91%,纯化倍数19。黄瑛等采用10%的PEG2000、15%的磷酸盐和1%的NaCl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G-63发酵粗酶液中提取脂肪酶,当系统的pH为8.0时,分配系数4.36,纯化因子3.98,脂肪酶的回收率达到87.25%。(3)分离提纯蛋白质刘杨等以PEG/硫酸钠双水相体系,经一次萃取从钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白。结果表明,萃取最适宜的条件为12%PEG4000,15%Na2SO4,1%KCl,藻蓝蛋白收率为91.2%,分配系数达到8.01,分离因数达到6.33。对于螺旋藻藻蓝蛋白的富集分离,双水相萃取法与传统的盐析沉淀法相比,具有节省操作时间、简化操作过程、降低能耗和成本以及易于工艺放大等优点。Long等描述了生物偶联技术对胶状金纳米粒子在聚乙二醇(PEG)/葡聚糖双水相系统(ATPS)中分离蛋白质的影响。山葵过氧化物酶(HRP)通过直接吸附结合胶状Au纳米粒子。虽然HRP很少存在于相中,但HRP/Au纳米粒子结合分离到PEG相,结合15nm胶状金的因子高达150∶1。其他蛋白质/金纳米粒子结合在右旋糖酐相中分离大于2000∶1,而自由蛋白为5∶1。分离程度取决于聚合物浓度,分子量,纳米粒子直径,在某些情况下取决于纳米粒子在ATPS中的浓度。通过结合金纳米粒子大幅度提高蛋白质分离,在既不改变蛋白质的化学性质或聚合物的亲和力配体,增加聚合物浓度,也不增加盐类浓度的情况下,很大程度上归因于偶联物表面积的增加。吸附胶体粒子从而提供一个有吸引力的路线,以增加酶和其他蛋白质在ATPS中的分离。此外,这些结果表明在净化生物分子/纳米粒子结合中ATPS分离作为一个强有力的手段,正越来越多地应用于诊断和材料方面。Silva等[25]研究了不同分子量的PEG和pH值在聚乙二醇(PEG)+磷酸钾+尿素+水双水相体系中的液-液平衡,描述了实验技能和分析方法,得出了25℃时PEG(1450,3350,10000)+磷酸钾(pH7和9)+尿素(质量分数为6%)+水的双水相体系的平衡数据。每个体系测得了4条连接线。研究了25℃时pH7和9,尿素质量分数为3%和6%的体系中溶解酵素、过氧化氢酶、U-牛乳糖的分离现象。(4)萃取其他生物活性物质Luechau等研究了聚乙二醇-磷酸盐双水相体系分离DNA(pDNA),让一个高分子量(HMW)PEG1450和一个低分子量(LMW)的聚合物PEG300与磷酸氢二钾结合。实验结果表明质粒pTX0161在PEG-磷酸盐双水相具有不同的分配系数。在HMWPEG(PEG1450-磷酸盐体系),pDNA只分离到下相。在LMWPEG(PEG300-磷酸盐体系),pDNA根据双水相体系中的相组分、体系温度和溶菌液的浓度分离到不同相。在体积比大于1的体系中,pDNA主要分离到上相。体积比在0.5—1时,pDNA主要分离到界面。体系比小于0.5的体系,大部分pDNA在下相。在4—25℃时,分离到上相的量减少,但是分离到界面的量稳步增多。在25℃时,大于80%的pDNA分离到界面。随着温