双脱氧末端终止法测序

1快速序列测定：双脱氧末端终止法06级生科A班苏狄064120202摘要：核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。关键词：快速序列测定、双脱氧末端终止法目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencingbyhybridization，SBH）等。双脱氧末端终止法测序一、原理双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷2酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-4-1），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。双脱氧链终止法测序原理如图7-4-2所示。A,C,GorTOOOHPOOHPOOOHOHOHOOPH1'2'3'αβγA,C,GorTOOHPOOHPOOOHOHOHOOPH1'2'3'αβγdNTPddNTP图7-4-1脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构5′GAGTCACACTTGAC——3′待测单链DNA3′CTG—5′引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量α-32P-dATP3图7-4-2双脱氧链终止法测序原理二、Sanger法DNA测序的试剂（一）模板有两种类型的DNA模板可以作为Sanger法测序的模板，即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。1．单链DNA模板：在一般情况下，可将靶DNA片段克隆于M13mp载体，从重组克隆M13mp系列噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板。这种单链模板效果最佳，只要细心掌握模板与引物的最佳比例，有经验的测序人员通过一次末端终止反应，能读取500个以上的核苷酸序列。2．经热变性或碱变性的双链DNA模板：尽管采用变性双链DNA作测序模板显然简单且方便，但实际上很难获得单链模板那样的满意结果。利用双链质粒模板测序，其中有两个至关重要的因素，即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制GAGTCACACTT测序图谱识读变性凝胶电泳、放射自显影ATCG5′3′加ddATP反应3'ACTG—5'3'AACTG—5'3'AGTGTGAACTG—5'加ddCTP反应3'CAGTGTGAACTG—5'3'CTCAGTGTGAACTG—5'加ddTTP反应3'TGAACTG—5'3'TGTGAACTG—5'3'TCAGTGTGAACTG—5'加ddGTP反应3'GAACTG—5'3'GTGAACTG—5'3'GTGTGAACTG—5'4备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆往往因为有污染而并不可取，高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。其次是应采用高质量的聚合酶。一次末端终止反应亦可能读出300核苷酸序列。应该注意的是，适合做双链模板的质粒，最好具有较高的拷贝数并有插入失活的选择标志，有配套的通用引物结合区。最常用的载体系统是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。双链模板测序最大的优势是对已知序列DNA的亚克隆进行鉴定，可省略再经M13载体亚克隆获取单链模板过程。（二）引物酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。在许多情况下，可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。但也可以采用Sanger法商定变性双链DNA模板的序列。在以上两种情况下，都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。适于M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15-29个核苷酸，并可与紧靠M13mp18噬菌体多克隆位点区的HindⅢ位点成M13mp19噬菌体多克隆位点区的EcoRI位点的序列互补。这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进行“双链”测序，并可从许多厂商中购置得到。此外，还有若干家公司出售一些引物，这些引物下为了对通过多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进行测序而设计的。（三）DNA聚合酶如前所述，选用合适的DNA聚合酶进行测序反应也是保证测序质量的重要因素之一。常用于双脱氧末端终止法测序的有几种不同的酶：其中包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文献，如Mieredorf和Prfeffer，1987）经过修饰消除了3'→5'外节酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶（Sequenase）和测序酶2.0），Tabor和Richardson，1978]惟及从嗜热水生菌（T'hermusaquaticus）分离的耐热DNA聚合物（TaqDNA聚合酶）。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的DNA序列的数量的质量。（1）大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段：这种酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶。通常碰到的两个问题是：1）Koenow片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于ddNTP的掺入，而是因为聚合酸人模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。由于该酶不能5沿模板进行长中距离移动，因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有限。通常，这一反应只能得到大约250-350个核苷酸的序列。如果分两步进行反应，所得序列的数目可以翻一番；其中第一步是初始标记步骤，采用低浓度的dNTP，而随后的第二步是链延伸－链终止反应，含有ddNTP和高浓度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了这些改进，用Klenow酶所测序列的长度通常还是不如持续合成能力较强的测序酶。2）这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。将聚合反应的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题（Gomer和Firtel，1985)。有时可采用一些dNTP类似物[如dITP或7－脱氮dGTP（7－deaza-dGTP）]来获取模板中可形成稳定二级结构的相应区段的序列信息，但Kleow酶对这些类似物的作用不如测序酶有效，这也许是因为它们使Klenow酶原已较低的持续合成能力进一步降低。总而言这，可以选用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段测定从引物5'位置起250个碱基以内的一段DNA序列，但不宜用它来测定更长一段DNA序列或者具有二重对称和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。（2）反转录酶：尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶解决一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸区而引起的问题。来自禽类和鼠类反转录病毒的反转录酶在这一看来要比Klenow酶略胜一筹（Karanthaansis，1982;Graham等,1986）,尽管它们也许还是比测序酶逊色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。（3）测序酶：测序酶（SequenaseTM）是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。这酶原来具有很强的3'→5'外切核酸活性，经过修饰后，这一活性大部分均被消除。测序酶2.0版是测序酶的基因工程产品，它完全缺失了3'→5'外切核酸酶活性，极其稳定而经活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如dITP和7－脱氮－dGTP等用于提高分子辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的耐受性。它是测定长段DNA序列的首选酶。测序酶可以沿模板移动很长的距离，因而一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的DNA序列。实际上，测得序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。为了充分利用测序酶极高的持续合成能力，可采用两步测序反应。第一步首先采用低6浓度的dNTP的较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP和较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP的有效掺入，这步反应的产物是仅仅延伸了20-30碱基的引物。再将第一步反应等分于4组1套的标准反应系统中，每组反应中都含有高浓度的dNTP和一种ddNTP。这样聚合反应就得以继续，直至造成链终止的核革酸掺入正在增长的链中。（4）TaqDNA聚合酶：适用于测定在37℃形成大段稳定十级结构的单链DNA模板序列。这是因为TaqDNA聚合酶在70-75℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。按照1nnis等（1988）介绍的方法使用TaqDNA聚合酶进行测序，在放射自显影片上得到的测序梯连续数百个碱基条带始终清晰如一，表明这种酶的持续合成能力甚佳。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。循环测序反应与普通PCR反应有所不同。只需一条引物，通过单引物进行热循环，模板DNA以线性方式被扩增，而不是标准PCR的指数方式扩增；反应底物除四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入了双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），进行扩增时，链的延伸终止于掺入ddNTP的位置，产生分别终止于不同核苷酸的一系列不同长度的扩增片段。（四）放射性标记的dNTP传统的DNA测序方法都采用α-32P-dNTP作为放射性标记物，但由于32P发射的高能β射线，常会引起二个问题。首先是导致放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性。其次是32P衰变会导致DNA样品分解，通常都应在测序反应后24h内进行电泳，否则无法获得好的结果。近年来α-35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的β射线，克服了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反应产物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。（五）dNTP类似物二重对称的DNA区段（特别是GC含