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地膜旱作对菜田中土壤微生物群落结构及生态环境的影响——以兰州市夏官营镇高敦营村花椰菜菜田为例Ⅰ、研究目的为探究干旱地区花椰菜菜田在不同覆膜处理下微生物种群及其生物总量随着时间推移呈现的变化趋势。主要探讨有地膜和无地膜覆盖这两种情况所带来的各种因子（包括气压，C、N、P含量等）对菜田中的微生物种群数量变化的影响，并对其做相关线性分析，最后对该区块菜田做一个宏观的环境影响评价。Ⅱ、研究背景1.从20世纪50年代初开始,随着塑料工业的发展,日本和欧美发达国家开始将塑料薄膜应用于农业生产中。地膜覆盖增温、保水功能导致农作物增产及作物适作区扩大,该项技术带来了农业生产方式的改变和农业生产力的飞跃。虽然中国从20世纪70年代末才开始进行相关研究,80年代才开始将地膜应用于农业生产,但应用面积和范围却后来居上,已经成为地膜覆盖栽培面积最大的国家。地膜覆盖栽培是农业生产中的一项有效增产措施，近些年来在我国北方旱区农业生产中被广泛推广和应用,特别是在黄土高原,地膜覆盖玉米的栽培面积逐年扩大。地表覆膜后改变了土壤温度、水分、空气、光照等环境因素，导致土壤物理、化学和生物学性状发生一系列的变化，从而影响农田作物生长发育及土壤中微生物的繁殖等。2.土壤微生物是土壤中物质转化和养分循环的驱动力。微生物量被认为是土壤活性养分的储存库,是植物生长可利用养分的重要来源，同时又能灵敏地反映环境因子的变化,所以,它又可作为评价土壤质量的重要指标之一。土壤微生物群落是土壤生物区系中最重要的功能组分,不仅土壤微生物本身是土壤养分重要的“源”和“汇”，支撑着土壤肥力。它还对所生存的微坏境十分敏感,能对土壤生态机制变化和环境胁迫做出反应，导致群落结构会发生改变，所以被认为是土壤生态系统变化的预警及敏感指标，指示土壤质量变化。此外，土壤微生物多样性代表着群落结构的稳定性，土壤微生物通过调节有机质的分解动态平衡和营养对植物的可利用性来调节土壤生态系统。利用磷脂类化合物中的脂肪酸组成来估价土壤微生物群落结构是近几年一种常用的生化方法。PLFA是微生物量的活性部分，能较为准确地反映土壤微生物的相对生物量及脂肪酸图谱，可以对土壤微生物群落进行动态监测，更客观地反映土壤生态系统的健康程度和波动情况，使之为人们所了解和调控。3.花椰菜,又叫绿菜花、青花菜、西兰花，原产于欧洲地中海沿岸的意大利一带，19世纪末传入中国。兰州市榆中县种植西兰花已有25年的历史，榆中地处西北的黄金种植区，县域内土层深厚，气候温和，光照充足，热量丰富，降雨量适中，昼夜温差大，风力小，这为花椰菜的生长提供了有利的环境条件。榆中的花椰菜长势强健，耐热性和抗寒性较强，植株高大，翠绿秀丽，叶柄狭长，品质鲜嫩，色泽洁白，质地紧密，外形美观。悠久的蔬菜栽培历史加上现代高新技术已在榆中形成了一整套精湛的蔬菜栽培技术体系，有利的自然环境和成熟的栽培技术造就了榆中西兰花优良的品质和鲜明的地域特征。我国对于地膜的研究开展比较晚，研究数据比较早，而且研究多立足于覆膜对土壤养分和土壤环境效应的影响以及提高地膜使用效率等方面，如宋秋华等（2002）、杜社妮（2007），而作为高原夏菜的种植基地的榆中县，研究其地膜对菜田中土壤微生物群落结构及生态环境的影响就显得较为意义重大。Ⅲ、研究内容1.在有膜和无膜条件下土壤中一些不同的因子（光照、内部温度、氧分压等）对土壤中主要微生物的影响，以氨化细菌、硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌、纤维素分解细菌、解磷细菌、放线菌为主要研究对象进行探讨。2.对微生物群落结构影响则以PLFA含量测定来进行对比。3.在花椰菜不同生长时期，及各种不同温度、湿度条件下对上述微生物群落数量及土壤有机物总量的线性关系。4.对比在有膜与无膜条件下上述曲线的变化，及各种因素对曲线的影响。5.有膜与无膜在蔬菜种植过后，对土壤主要理化性质的影响。6.有膜与无膜小区块菜田对农田小生态环境影响评价Ⅳ、可行性分析设备与场地：1.本实验场地主要选择在甘肃省兰州市榆中县夏官营镇高敦营村兰州大学榆中校区附近，共选取六块样田。设备提供包括兰州大学榆中校区生物实验中心和资源环境土壤、环境分析实验室、兰州大学本部生命科学实验楼、兰州大学本部化学实验中心、中科院干旱与寒冷环境研究所。这些场地已经有所联系且我院多数项目均可以在此环境下操作完成。2.实验室设备较为齐全，包括离心机、凯氏定氮仪等均可以保证实验的良好开展。3.写下实验仪器编号不知是否需要实验材料：1.本实验采样地点定于兰州大学榆中校区附近高墩营村的菜田，采样点已经经过了初步勘查和调研，也已经和当地乡民有所沟通，同意了实验的开展。2.本实验所用的药品试剂均为较为普遍且易获得的实验室常备试剂，而且生产厂家较多，质量也比较有保证，可以在化学药品销售点直接购得。实验方法：1.本实验测试方法采用重铬酸钾容量法、全氮测定用半微量开氏法、碱解扩散法以及需要进行微生物处理的一系列方法，这些多数为国际上普遍承认的标准法以及经过大量实验证明的可行性很高的方式来进行操作,这样提高了我们项目的完备、可操作性以及数据的可靠性。2.数据处理也将使用大学生所最为熟悉的Excel，以及Spass等软件辅助编辑，该方法精确性较高，且适用范围广，可以进行大量数据处理分析。知识背景与资源：1.本项目在申请之初就已经参阅了大量文献和资料，对于本课题背景和主旨已经进行了相当的了解，这些相关资料以及实验方法都可以在图书馆以及网络资源中进行补充和了解；2.本项目的指导老师为南忠仁老师。南老师在指导学生项目方面经验丰富且本身也研究过多个土壤的相关课题，同时其热心认真的专业态度也可以良好的感染到我们小组的所有人。3.本课题小组的学生均是具备了该专业的基本知识，同时也参与过一些创新创业和暑期实践项目，本身也是有着饱满的专业热情和认真谨慎的态度对待本次项目，相信在师生的共同协作下，该项目将会顺利进行。综上所述，本项目设备场地完备，研究方案可行，背景资源丰富且实施人员专业，同时在指导老师的指导下，该课题一定能够很好地开展和进行。Ⅴ、基本思路采样（手动取样）样品预处理（筛土以及风干）数据分析与处理文字论述土壤理化性质测定微生物群落状况分析微生物数量状况分析花椰菜生长状况分析氨化细菌、解磷细菌、放线菌的测定（洗涤稀释平板法）硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌和纤维素分解细菌（洗涤稀释法）土磷脂脂肪酸的测定壤微生物（在White的方法上加以改进）维他命C含量测定(二甲苯萃取比色法)各块样田所产花椰菜平称重，取平均数Ⅴ实验方案：1.采样由于土壤的不均一性，使各个个体都存在着一定程度的变异。因此，采集样品必须按照一定采样路线和“随机”多点混合的原则。本次实验将选取3块覆膜花椰菜菜田及3块已五年以上覆膜历史但本次实验不覆膜对照组。花椰菜主要根群分布在30cm大耕作层内。高60-90cm，被每次采样每块样田取一洞，故分别3个样本：覆膜底层接触覆膜土壤，距覆膜垂直距离30cm土壤，距覆膜垂直距离90cm。每次采样采取S型采样方法。采样时间在2012/2/15开始在，播种前一天增加一次土壤采样，以了解播种前的起始状态，第一茬花椰菜播种开始后，每两周（14天）采样，由于花椰菜从定植到采收80-90天，故本次实验一个周期供需采样12次，共得样本288土壤样本。本次实验共进行两个周期，故采样次数24次，所得土壤样本432个。实验持续八个月。由于花椰菜营养价值较高，并且为维他命C含量最丰富之蔬菜，故，本次实验对花椰菜生长状况以每千克所含维他命C毫克量为标准。采用无菌塑料袋包装，在袋内充分混合，置于4℃冰箱中保存以备用。2.样本分析2.1土壤基本理化性质分析2.1.1土壤的温度测定土壤温度用地温计在每日8:00、14:00、和20:00定时测定5cm土壤深度的温度。2.1.2土壤电荷测定Mehlich法(HuiZhang,etal.EmpiricalApproachesonSoilEvironment.ShanghaiJiaotongUniversityPress2009,57-59)。2.1.3土壤含水量用烘干称重法测定,然后取平均值。2.2土壤微生物数量状况分析土壤有机质测定用重铬酸钾容量法;全氮测定用半微量开氏法,消化后用凯氏定氮仪进行分析;NH+42N用碱解扩散法,直接用凯氏定氮仪定;NO-32N和NO-22N用2mol/LKCl浸提后,在流动注射分析仪测定;速效磷用NaHCO3浸提,钼蓝比色法测定。微生物的分离、培养和计数,氨化细菌、解磷细菌、放线菌采用洗涤稀释平板法,硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌和纤维素分解细菌采用洗涤稀释法。微生物总数为各主要类群微生物数量之和。微生物数量单位以每克干土所含有的微生物个数(Num/gdrysoil)来表示。2.3土壤微生物群落状况分析（土壤微生物磷脂脂肪酸的测定PLFA）在White的方法上加以改进（WHITEDC,DAVISWM,NICKELSJS,eta1.Determinationofthesedimentarymicrobialbiomassbyextractiblelipidphosphate[J].Oecologia,1979,40:51-62.）。(1)提取:鲜土加入柠檬酸缓冲液:氯仿:甲醇=0.8∶1∶2,25℃避光震荡,离心,再加入柠檬酸缓冲液:氯仿:甲醇=0.9∶1∶1,震荡,避光保存。经18h分离后,保留底层氯仿相在氮气流下吹干。(2)分离:用柱层析硅胶玻璃管柱依次分别加入10ml氯仿、10ml丙酮、10ml甲醇,收集到甲醇相为所提取的磷脂脂肪酸。(3)甲脂化:加入1ml甲醇:甲苯(1:1)和1ml0.2mol/L-1KOH甲醇溶液,水浴36℃,冷却到室温,依次加入2ml去离子水（蒸馏水也可）,0.3ml1mol/L-1HAc,2ml正己烷,漩涡,离心,加入甲脂化的C19∶0为内标,氮气流下吹干,-20℃冷冻保存。外标样为SupelcoTM37ComponentFAMEMix和BacterialAcidMethlEstersMix(SupelcoUSA)。检测条件:本实验检测由安捷伦GC-MS(6890N-5973N)完成。色谱柱为hp5-MS(30m×250μm×0.25μm)石英毛细管柱。GC-MS分析条件:柱温:70℃(5min)20℃/min190℃5℃/min200℃10℃/min280℃,进样口温度为250℃,载气为He(0.9ml/min),分流比为:10:1,离子源温度230℃,四极杆:150℃,质谱全扫描范围:30～600mHz。2.4花椰菜生长状况分析2.4.1维他命C含量测定(二甲苯萃取比色法)（1）标准曲线取具塞大试管6个，分别吸取抗坏血酸标准溶液0ml、1ml、2ml、2.5ml、3ml、4ml，用1%草酸补充至4ml。各管中加入染料溶液2ml，随即加入二甲苯5ml，迅速摇动约0.5min，静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液在500nm波长下测吸光度。以二甲苯作为空白调零，求得标准系列抗坏血酸回归方程。（2）样品提取取新鲜花椰菜洗净，擦干，切碎，称取2g样品至研钵中，加入3ml2%草酸溶液磨至匀浆，然后倒入100ml容量瓶中，残渣用1%的草酸溶液冲洗，加入1ml30%硫酸锌，摇动容量瓶，再加入1ml15%亚铁氰化钾，以除去脂溶性色素，再用1%草酸溶液定容至刻度，摇匀后过滤。（3）测定提取液在500nm处的吸光值并与回归方程比对计算出维他命C含量。2.4.2各块样田所产花椰菜平称重，平均数2.5其他数据气象数据由兰州大学榆中校区气象站提供。3.数据处理处理样本之间的差异用T测验检验,相关性用线性相关性分析,显著性水平均为p=0105。本实验所得数据通过Excel软件、PLFA图谱处理软件处理获得。Ⅴ、试验计划前期准备：获得历年榆中地区气象资料，以及样田历年施肥情况。设计本次实验期间样田施肥计划，并严格按照施肥计划施行。在兰州大学提交租用实验室及设备申请，联系实验试剂及仪器供应商准备实验所用药品与仪器。联系指导老师分析实验过程中各种注意事项及分析具体步骤。