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地高辛标记探针的DNA印迹方案SouthernblotusingDIGProber(分子生物学实验室)StepI采用地高辛高效标记混合物(ROCHE)标记DNA探针1以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度浓度测定：将回收产物取1μl稀释5倍，标准分子量的标记物MAKER分别点1μl，2μl，4μl，6μl.然后比较回收产物的条带亮度与MAKER比较后，可以粗略估算浓度。2取1μg模板（第1步扩增回收产物）于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸水至终体积为16μl。3沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性（1）摇匀DIG-HighPrime（vial1），取4μl加入已热变性的模板DNA中，混匀后，瞬时离心，37℃保温20h，65℃处理10min终止反应。4取１μl电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。５标记好的DNA探针－20℃保存。StepII基因组DNA酶切1提取高质量的基因组DNA，浓度1μg/μl;测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。2选择合适的内切酶（酶切的DNA量20μg左右。注意考虑到纯化的损失，约30%，酶切DNA浓度过大时，可以考虑多做几管做浓缩）。50μl酶切反应体系：EcoRI(15U/μl)5μl10×Mbuffer5μlgDNA10μl（约10-20μg）ddH2Oupto50μl注：有些内切酶需加BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。337℃酶切12h（电泳检测），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。65℃保温10min停止酶切反应。StepIII预电泳和电泳1配制0.8%的琼脂糖凝胶（大胶40ml左右，胶薄较好，利于转膜）。2加入适量上样缓冲液（LoadingBuffer）点样，点上质粒做对照。注：两边的点样孔尽量空出来；点上marker,再单独一点样孔用溴酚兰做指示，防止跑过。3120V，5min；40V，4h。溴酚蓝前沿跑至胶边约1厘米处即可。StepIV转移胶处理与转膜电泳后用EB染色，紫外光下拍照，然后，切下marker和右上方一角。1凝胶在灭菌的双蒸水中漂洗片刻。2.室温下凝胶在0.25MHCl中浸泡15min，使DNA脱嘌呤，摇床上缓慢摇动，（溴酚蓝由蓝色变为黄色）灭菌的双蒸水中漂洗凝胶。3凝胶转移到10倍于凝胶体积的变性液（1.5MNaCl，0.5MNaOH）中轻轻振荡20min；换液一次，继续漂洗20min。4灭菌的双蒸水漂洗凝胶片刻，然后置于10倍于凝胶体积的中和液中轻轻振荡20min，换中和液重复一次。换培养皿，用20×SSC转移缓冲液漂洗一下仪器：大培养皿3套换洗过程很重切记清顺序StepV转膜1将尼龙膜漂浮于超纯水中至完全浸润，转移至20×SSC转移缓冲液中浸泡15min。先尼龙膜再倒水和缓冲液，保证完全浸润。2组装转移装置：玻璃板+滤纸桥(边缘完全充分浸入20×SSC转移缓冲液)+1张滤纸+凝胶(背面朝上)+尼龙膜（做好标记）+滤纸（3层）+吸水纸+玻璃板+500g重物（如下图）方向注意每层都要用玻棒排净气泡。3毛细转移装置如图。在20×SSC转移缓冲液中毛细转移24h，为提高转膜效果可以适当延长时间；转膜期间经常更换吸水纸及加液（注意防止短路！！：用封口膜在四周封好，防止膜上吸水纸接触到膜下缓冲液）。4转膜结束后，凝胶拍照检测DNA残留状况。5.取膜，（用铅笔标记样品孔的位置，切角标示方向）毛细转移法具体步骤：1．20×SSC浸湿一张whatman3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。2．凝胶反放在浸湿的whatman3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。3．用塑料膜包裹膜的边缘，照凝胶的大小剪一张尼龙膜。4．膜（20×SCC平衡过）放在凝胶上。5．尼龙膜上放一张whatman3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。StepVI固定，预杂交，杂交1将尼龙膜浸入6×SSC溶液中2～5min，除去黏附在膜上的凝胶碎片。2固定：把膜放在两层干燥的吸水纸中央，80℃烘烤2h。处理后的膜直接用于杂交或用保鲜膜包裹干燥保存于冰箱。3配制地高辛杂交液：用64ml的无菌超纯水分两次加入DIGEasyHybGranules（vial7）中，迅速于37℃振荡5min至溶解。（因为试剂盒中vial7是用大约75ml左右的小瓶装的，原试剂是冻干粉样，配制杂交工作液需加入64mlddH2O，若一次加入会产生大量气泡至溢出，需要先少量加入ddH2O，待其溶解后再加入剩下的部分。）4将事先加入杂交液（DIGEasyHyb，vial7，10ml/100cm2）的杂交瓶预热至42℃，固定好的尼龙膜轻轻卷成圆柱状放入杂交瓶中42℃预杂交30min，以封闭非特异性位点。5倒掉预杂交液。标记好的探针(25ng/ml)沸水浴5min（用１.５ml管并用封口膜封好）,迅速冰上冷却后,加入预热至42℃的杂交液中（3.5ml/100cm2尼龙膜，混合均匀避免产生气泡）。加液顺序：沿壁加5ml杂交液－探针－5ml杂交液，防止产生气泡。6将尼龙膜完全接触杂交液，42℃杂交16-20h，杂交过程避免有气泡。（杂交液冷后会凝，可回收放－2０℃用于下次，不凝则探针浓度少）。StepVII洗膜1低严谨洗脱：杂交结束后，用2×SSC，0.1%SDS洗脱液（现配用时25℃预热）15-25℃振荡洗涤2次，每次5min（视膜大小配溶液以没过膜为准）。（配时先放水后入SSC、SDS可防沉淀）2高严谨洗脱：用预热的0.5×SSC，0.1%SDS洗脱液（现配）65℃-68℃振荡洗涤2次，每次15min（在杂交炉中进行）。3再用１００－１５０mlWashingbuffer洗膜5min，滤干洗液进行显色处理。StepVIII显色试剂配制（现配）：封闭液1×工作液的配制——取12ml的10×blockingsolution（vial6）用马来酸buffer稀释至120ml。抗体溶液的配制——每次使用前Anti-Digoxigenin-AP（vial4）10000rpm离心5min，吸取4μl上清加入20ml封闭液（1×工作液）中。显色液的配制——加200μl的NBT/BCIP储存液（vial5）（上清）于10ml的Detectionbuffer中。（避光）1将杂交膜置于盛有100ml封闭液（Blockingsolution）的培养皿中，室温缓慢摇动30min。2转到盛有20ml抗体溶液（Antibodysolution）的培养皿中，室温缓慢摇动30min。3在100ml的Washingbuffer中洗膜2×15min，缓慢振荡。4在20ml检测缓冲液(Detectionbuffer)中平衡2-5min，缓慢摇动。5用新配制的10ml显色液温浴膜,黑暗静置（37℃培养箱）至出现明显条带（3h－20h）。6用50mlTEbuffer洗膜5min停止显色，白光拍照记录。Southernboltting试剂配置1.变性液；87.75gNaCl,20.0gNaOH加水至1L2.转膜液20×SSC175.3gNaCl,88.2g柠檬酸钠,用浓盐酸调节pH至7.0,定容到1L3.中和液：175.5gNaCl,60.55gTris调节pH至7.4加水至1L,4.MaleicAcidbuffer11.61gMaleicAcid,8.775gNaCl，固体NaOH调PH至7.5加水至1L5.Washingbuffer11.61gMaleicAcid,8.775gNaCl，固体NaOH调PH至7.5，加入0.3%Tween20过滤灭菌总量至1L4Detectionbuffer:0.1MTris0.1MNaCl，PH：9.5