垂直板电泳分离蛋白质--教学课件

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质韩文军周晓慧生物技术教研室一、实验目的•了解电泳实验原理•掌握电泳实验操作规程•学习用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理与技术二、电泳的基本原理•电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。三、电泳的分类•从原理上：区带电泳，移界电泳，等速电泳，等电聚焦（IEF），双向电泳等。•凝胶系统的均匀性：连续性凝胶电泳，不连续凝胶电泳•按外形：圆盘状电泳，水平板电泳，垂直板电泳及毛细管电泳等。•被分离的物质是否变性：非变性、变性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）•从载体上：自由流电泳，凝胶电泳，琼脂糖电泳，纸电泳等。四、电泳中的一些基本概念•1.凝胶浓度（T）•2.交联度（C）•3.分离胶•4.浓缩胶•5.迁移率•6.指示剂•7.聚合•8.固定•9.染色•10.脱色五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳•1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点•（1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(CH2=CHCONH2简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2)2简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶（其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节），以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。常用于蛋白质的定性分析，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。•（2）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。•（3）强还原剂可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，SDS与蛋白质充分定量结合（平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子），以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构，消除了各种蛋白质本身电荷上的差异，从而使蛋白质电泳的速度只与蛋白质的分子量相关，而与蛋白质本身所带电荷无关。（4）由于具有浓缩效应、分子筛效应和电荷效应，使被分离物质在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。•图4电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。（5）利用特异性的颜色反应使蛋白质着色，这样就可在凝胶中展现出蛋白质条带。2、仪器设备及试剂•（1）仪器设备：•恒流恒压电泳仪及配套电泳槽•冷冻离心机及离心管•制冰机•pH计•真空机•取样器•进样器(2).试剂•30%凝胶贮液–29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺加双蒸水溶解后定容到100ml，过滤后贮存到棕色瓶。•浓缩胶buffer（0.5MTris-HCl,pH6.8)–6.06gTris,0.4gSDS,加双蒸水80ml溶解,用HCl调pH为6.8后定容到100ml，过滤后贮存•分离胶buffer(1.5MTris-HClbuffer，pH8.8)–18.17gTris,0.4gSDS,加双蒸水80ml溶解，用HCl调pH为8.8后定容到100ml，过滤后贮存•Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3)–30gTris,10gSDS,144g甘氨酸，加双蒸水800ml溶解后定容到1000ml•固定液–甲醇200ml，乙酸50ml，加水定容到500ml.•考马斯亮蓝染色液–42ml水，58ml磷酸加50g硫酸胺溶解后再加0.6gG-250溶解，加水定容到400ml，再加入100ml甲醇•AP%–100mg过硫酸胺溶于1ml水•上样缓冲液–1gSDS，5mlGlycerol,0.5mgBromophenolblue,2.5ml巯基乙醇,10ml浓缩胶buffer,ddH2Oto50ml.•0.1%溴酚蓝水溶液3.SDS-PAGE实验步骤分离胶的制备浓缩胶的制备加样待分离样品的制备电泳剥胶固定染色、洗脱（1）11.5%分离胶配制(20ml)•凝胶贮液7.7ml•分离胶buffer5ml•H2O7.25ml•10%AP54ul•TEMED9ul（2）.4.8%浓缩胶配制(6ml)•凝胶贮液0.96ml•浓缩胶buffer1.5ml•H2O3.5ml•10%AP18ul•TEMED4ul（3）样品处理•秤取样品0.2克，加上样缓冲液2毫升，加石英砂充分研磨，纱布过滤后在离心机上12000rpm离心10分钟，取上清液备用。电泳•浓缩胶：10mA•分离胶：20mA固定、染色与脱色•固定液固定30~40分钟•水洗4次，每次15分钟•染色液染色4小时或过夜•水洗脱色到背景清晰六、实验报告•１、实验名称•２、时间、地点•３、任课教师•４、学生姓名、学号、分组•５、实验目的•６、实验原理•７、仪器、试剂•８、实验步聚•９、结果及计算•１０、分析及讨论•1：Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩•2：玻璃管表面应光滑洁净，蔗糖溶液封住管底，否则会造成凝胶与玻璃管之间产生气泡•3：尽量不要破坏胶面，否则样品区带不平整。注意事项参考资料•张龙翔等，生化实验方法和技术（第二版），１９９７，高等教育出版社•中国科学院上海植生所编，现代植物生理学实验指南，科学出版社•张龙翔等，生化实验方法和技术（第1版），1981年，高教出版社•郭尧君，蛋白质电泳实验技术（第2版），2005，科学出版社•http//:166.111.30.161.index.php迁移率•迁移率:ν/E的含意为单位电场强度下的移动速度•相对迁移率:上式中：相对迁移率mR就是两种带电粒子在凝胶中泳动迁移的距离之比。（d－带电粒子泳动的距离，t－电泳的时间，V－电压，L－两电极交界面之间的距离，即凝胶的有效长度。）