反相色谱柱的选择.

反相色谱柱的选择WatersAsiaLtd.内容简介•合适的选择性•色谱峰之对称性•重现性–柱间与批次间之重现性（Column-to-Columnvs.Batch-to-Batch）–Waters色谱柱质量控制（CertificateofAnalysis）–Waters方法认证包（MethodValidationKit•高性能与宽适用范围对HPLC色谱柱的要求合适的选择性–满足不同的分离要求•良好的色谱峰形•重现性•宽应用范围C18填料的合成Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)传统硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口键合相硅胶基质填料键合相(配体)：C18残留硅羟基端基封口基团硅胶基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口端基封口(Endcapping)•在第一步主要的配体(C18)键合后，第二步键合过程。目的是“覆盖”未反应的硅羟基•使用小硅烷(TMCS)•降低硅羟基活性(有利于碱性物质获得好的峰形)•在pH2时，封口之短链烷基水解迅速为什么这些硅胶反相C18填料如此不同？•色谱测试结果显示：–疏水性不同–残留硅羟基活性不同•为什么？–不同C18配体键合水平（状况）•配体密度–不同硅胶颗粒基质•密度，表面积，孔径•纯度色谱柱选择性比较表Hypersil®BDSC18Symmetry®C18Inertsil®ODS-2Inertsil®ODS-3Kromasil®C18YMC-Pack™ProC18™YMC-Pack™ODS–AQ™Nova-Pak®C18Hypersil®ODSYMCJ'sphere™ODS–H80YMCJ'sphere™ODS–M80Nucleosil®C18µBondapak™C18YMCJ'sphere™ODS–L80WatersSpherisorb®ODS1Resolve®C18WatersSpherisorb®ODS2-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.5疏水性增加硅羟基活性降低(ln[a]amitriptyline/acenaphthene)(ln[k]acenaphthene)选择性变化小结：•填料的疏水性以及残留硅羟基活性是决定色谱柱选择性的重要因素，因此，在选择色谱柱时应充分了解填料的性质。•色谱柱选择性比较表对合适色谱柱的选择具有指导意义。对HPLC色谱柱的要求•合适的选择性良好的色谱峰形–定量精度、灵敏度与分辨率–两项改善色谱峰形的新技术•重现性•宽应用范围对称峰形的益处•更准确与精确的定量结果–纯度分析–稳定性分析•更高的灵敏度–更好的检出限与定量限（LODandLOQ）–对低浓度杂质有更强的检测能力•更强的分辨能力-更好的分辨率–更有利于相邻色谱峰的分离ab峰高之5%处•USP拖尾因子（TailingFactor）:T＝•不对称因子色谱峰对称性的衡量方法ab)(a2+99.6%99.8%99.9%峰面积回收率T=1.0092.3%95.3%97.8%T=1.58Waters21,379峰面积回收率由于拖尾引起的积分误差由于拖尾引起的灵敏度差异他莫昔芬0.25g/mL信噪比11.06.5AUSymmetryC18AU5.0010.00MinutesConventionalC18峰形对分辨率的影响Rs=(trPeak2–trPeak1)/0.5(w4.4%Peak1+w4.4%Peak2)Rs=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)Rs=0.72Minutes0510152025注意：基线分离的分辨率=1.5何种原因导致不好的峰形？以碱性物质为例硅胶颗粒中金属离子的浓度硅醇（羟）基与碱性物质之相互作用AmitriptylineMinutes515253545Symmetry®C18Alconc.10ppmTFUSP=1.9Nova-Pak®C18Alconc.=~375ppmTFUSP=6.4金属离子浓度对色谱峰形的影响何种原因导致不好的峰形？以碱性物质为例硅胶颗粒中金属离子的浓度硅醇（羟）基与碱性物质之相互作用混合模式保留机理：与键合相碳链的疏水相互作用与带电硅羟基的离子交换作用O-SiO-SiO-O-SiO-SiO-O-SiO-O-SiO-SiO-SiO-O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+流动相pH3Si-OH-流动相pH3Si–O碱碱如何克服硅羟基作用？•七十与八十年代：–容忍碱性物质拖尾现象存在，使用流动相改性剂改善色谱峰形•九十年代以后：–改进反相色谱填料颗粒技术，降低不尽人意的硅羟基相互作用，内嵌极性基团技术小结：•色谱峰形的好坏是准确定量的决定因素•新型内嵌极性基团技术、杂化颗粒技术能够有效地改善色谱峰峰形。•高纯度硅胶填料的色谱柱具有优异的色谱峰形。对HPLC色谱柱的要求•合适的选择性•良好的色谱峰形重现性–色谱柱间重现性–批次间重现性•宽应用范围为什么重现性如此重要？•重现性是液相色谱分析的基本要求•缺乏重现性是用户最担心的问题•加快方法验证(Validation)的速度•更容易传递方法–instrument-to-instrument,andlab-to-lab•确保长期符合认证及系统适应性等要求—更容易符合法规要求柱间重现性与批次间重现性的区别•同一批次合成的填料—色谱柱之间的重现性–柱床填充质量控制•塔板数•色谱峰对称性•反压–无选择性差异•不同批次合成的填料—色谱柱批次间重现性–颗粒的物理性质–表面之化学性质Waters—严格的质量控制•所有原料的质量控制•填料生产过程控制•物理化学性质检验–CharacterizationofPacking•高质量，有色谱意义测试实验—确保批次间重现性小结•反相色谱填料的选择性与批次间重现性与硅胶的质量及键合相的生产过程密切相关•填料批次间重现性对方法长期之重复性至关重要对HPLC色谱柱的要求•合适的选择性•良好的色谱峰形•宽应用范围–分析速度–温度范围–pH范围