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反相高效液相色谱（RP-HPLC)报告人：杨羚2特点：高压、高效、高速、高灵敏高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。储液瓶手持控制器在线脱气机高压输液泵六通阀进样器柱温箱、色谱柱结构流程多肽/反相之间相互作用的吸附/脱附模型疏水部分与反相色谱柱的非极性基团吸附用RP-HPLC对固相合成的多肽进行纯化•固态多肽（SPPS）合成的多肽的纯化，需要除去由不完全偶联、去保护或外消旋化、侧链重排或在去保护和SPPS步骤中引入多种化学物质引起的非目的的肽。•一流动相的配制•①分别配置1L的洗脱液A（弱流动相）和洗脱液B（强流动相）•洗脱液A为0.1%TFA水溶液•洗脱液B为含0.09%TFA的60%乙腈水溶液•②在容量瓶中用Teflon包被的磁力转子搅拌将溶液混合•③用0.2umPTFE过滤器先过滤洗脱液A，然后过滤洗脱液B•④洗脱液预脱气•⑤用塞子塞进装有洗脱液的瓶子，避免有机溶剂挥发••二肽样品的制备•①先用终体积的一半的洗脱液A溶解样品以达到所需浓度。如样品不容易溶解，加入少量洗脱液B（＜25%总体积）•②检验样品的纯度，如果含有不溶的固体颗粒，用0.2umPTFE过滤器过滤样品，或离心后取上清液。•三RP-HPLC纯化固相合成的多肽•(1)检测HPLC系统设备•a用空白对照进样（进洗脱液A）并用与多肽相同的洗脱梯度进行洗脱（100%A→100%B），如果出现“鬼峰”（假峰）就重复操作。•b用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积•(2)用RP-HPLC分析多肽粗制样•a在正式分析样品之前，要现在同样条件下做一组空白对照。如果出现峰，则重复该步骤。•b以分析型RPHPLC的程序分离粗制制样（约100ug）。•c鉴定所要纯化的成分分析多肽粗制样spps步骤中所含有的少量化学杂质，会在后面230-280nm波长有非常强的吸收，所以这是一次预先分离，在214nm出检测。以确定主要的肽产物的保留时间，损失这几ug的样品。•(3)准备RP-HPLC•a按列出的实验条件，用制备型RP-HPLC程序来分离粗制肽混合物（约25-100mg）•b收集HPLC组分（3-7.5ml）（4）进行分析性RP-HPLC•a用分析性RP-HPLC所收集的组分（30-50ul）进行分析。•分别对空白对照、组织制样溶液、目标组分分析•b通过比较纯化后成分的保留时间和粗制样中靶成分在色谱的保留时间，来确定收集到的含有在有效浓度范围内（95%）目标蛋白的组分•c将得到的多肽定量分装在微量离心管中，-20℃保存，用于进一步研究。（5）进一步分析•a将95%以上的样品冻干•b对最纯组分进行离线或在线电喷雾离子化质谱（ESI-MS）,以确定合成的肽或蛋白是否正确，或者正确鉴定所要纯化的成分（HPLC）进行蛋白质的纯度检测及含量测定•分子量测定：用HPLC测定几个分子量已知的蛋白质，绘制分子量与调整保留时间相对应的标准曲线，然后再在相同条件下测未知蛋白的保留时间，用标准曲线对照即可的未知蛋白的分子量；•含量测定：用蛋白质标样配制一系列不同浓度的蛋白质溶液，绘制蛋白质浓度与峰高/峰面积相关的标准曲线，再在相同条件下测位置样品的峰高/峰面积，即可得未知样品的浓度；•纯度测定：保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，用目标蛋白的峰面积/峰高除以所有峰峰面积/峰高的总和即可的目标蛋白的纯度。主峰SPPS步骤裂解肽时加入的清除剂，在254nm处有较强的吸收度这是制备型RPHPLC对合成多肽的进行的分离层析柱微粒10um，流速7.5ml/min，PH2.1，254nm这是分析型RPHPLC纯化固相合成产物层析柱微粒5um，流速1ml/min，PH2.1，214nm能获得较高纯度的终产物基础是在制备型RPHPLC中采用较缓的梯度，并收集较窄的峰组分。用RP-HPLC技术对多肽和蛋白质混合物进行脱盐•在调节PH的时候，流动相中若使用非挥发性的盐，必须通过外加一步脱盐步骤使之从样品中去除。（注：TFA为挥发性盐）•一、流动相配置。•(1)配置缓冲液A（弱流动相）和缓冲液B（强流动相）各1L•缓冲液A(0.1％TFA水溶液)缓冲液B（0.09%TFA的2-丙醇溶液）•(2)在备好的量筒中用Teflon包被的磁转子将溶液搅拌均匀（时间视体积而定）•(3)用0.2umPTFE过滤器过滤缓冲液A和B.•(4)将洗脱液瓶用塞子封闭，以防止有机溶剂挥发。•二、多肽和蛋白质样品的制备(1)检查样品的纯度(2)如果存在不溶颗粒，用0.2umPTFE滤膜过滤，或者离心后取上清液••三、用RP-HPLC进行蛋白质脱盐•(1)检测HPLC系统•a、进空白样(用洗脱液A进样)，先在100%洗脱液A中等梯度洗脱，再在100%洗脱液B中梯度洗脱，所有条件都与蛋白质样品相同。•b、用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积，从而确定洗脱时间。(2)蛋白质脱盐a将含盐样品注入反相柱中，用100%洗脱液A洗脱，盐洗脱时间接近或正好是柱的死时间。b用100%洗脱液B一步洗脱或多步洗脱蛋白c收集含蛋白组分，以便进一步分析A----加样时间S----盐p-----纯化蛋白•流动相的强弱：因为是RPHPLC，固定相用的一般是非极性键合基团，用的是极性流动相，由于相似相溶的原理，极性小的溶剂洗脱能力强,水极性很强，所以洗脱液A是比较弱的流动相。（注：极性大的多肽组分先出来）TFA:TFA(三氟乙酸)，作为一种离子对试剂，是流动相的三要素之一。在流动相中加入适量的TFA可以酰基的离子化，同时有利于固定相键和硅胶表面残留的硅羟基质子化，减少碱性溶质发生离子交换作用可能性。TFA含量增加，肽保留减弱，色谱峰对称度提高；但TFA酸性强。容易造成固定相C18功能基团流失。所以综合各种因素，实验室大都用含量0.1%TFA进行分析。本实验的洗脱液B用的是0.09%，因为用水和有机溶剂洗脱时，为补偿梯度洗脱中基线的变化（短波下，有机溶剂吸收的光比水多），所以要降低B液中的TFA含量，从而产生平坦的基线。•过滤：有利于排出气泡，去除杂质，增加层析柱的使用寿命。脱气：一旦流动相中溶解02,流动相从色谱柱到检测器，压力下降，气泡便会产生，会增加基线噪声，造成灵敏度下降。超声脱气法•检测HPLC系统设备：能评价柱床完整性（低完整性与峰的分裂、峰的前伸或拖尾有关）和柱效能（根据塔板数），也能检测柱的寿命，并评估柱填充物批与批之间的差异。•空白对照进样：清洗前次分离多肽或蛋白质可能残留下来的杂质。