反相高效液相色谱法分离芳烃类化合物

实验1反相高效液相色谱法分离芳烃类化合物1.2.3.掌握用保留值定性及外标法色谱定量方法。流动相为液体的色谱称为液相色谱。经典的液相色谱由于大多在常压下操作，应用极为有限。高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上，根据色谱法理论，在技术上采用高压液泵、高效色谱柱和高灵敏度的检测器发展起来的一种仪器分析方法，具有准确、快捷、方便等优点，广泛地应用于化工、医药、食品、环保、科研等各个领域。液相色谱按分离机制不同可分为：液固吸附、液液分配、离子交换及空间排阻等几种类型。本实验属液液分配色谱。液液分配色谱是根据样品各组分在不相溶的两相间分配系数的不同从而实现分离的。流动相为有机溶剂、水或有机溶剂-水等混合溶剂，固定相是由固定液(如十八烷、聚乙二醇)涂渍在惰性载体或通过化学反应键合到硅胶表面上而组成的，它与流动相互不相溶，且有一明显分界面。当样品溶于流动相后，经色谱柱在两相间进行分配，待式中K是分配系数，k为分配比，cS和cM分别是组分在固定相和流动相中的浓度，VS和VM分别表示色谱柱中固定相和流动相的体积。k值除与组分的性质、固定相及流动相的性质有关外，还与温度、压力有关。在一定条件下，k值的大小反映了组分分子与固定液分子间作用力的大小，k值大，说明组分与固定相的亲和力大，即组分在柱中滞留的时间长，移动速度慢。分离顺序决定于分配系数的大小，分配系数相差越大，愈容易实现分离。根据所选用的流动相与固定相相对极性不同，液液分配色谱又分为两类：固定相的极性大于流动相的极性，称为正相分配色谱；固定相的极性小于流动相的SMMSVVkccK极性，称为反相分配色谱。化学键合固定相反相高效液相色谱中，流动相较简单，一般由甲醇—水、乙腈—水、乙腈—水—盐或甲醇—水—盐等体系构成，流动相的有机溶剂浓度、pH值和盐浓度的变化，可以改善洗脱强度，提高分离效果，所以，化学键合相反相HPLC色谱应用非常广泛，适于分离几乎所有类型的化合物。三、仪器与试剂1.仪器：岛津LC-10A高效液相色谱仪，色谱工作站，超声波清洗器，色谱柱(C18)，微量注射器(52.试剂：甲醇（色谱纯），苯（分析纯），甲苯（分析纯），萘（分析纯）四、实验步骤1.按附录中的Class-vp高效液相色谱仪中操作启动色谱仪，色谱条件为：色谱柱Shim-流动相甲醇∶水=80∶20(超声半小时脱气进样量:2检测器UV，检测波长灵敏度0.02～2.溶液配制：(1)储备溶液配制：准确称取苯2.000g、甲苯2.000g、萘2.000g分别置于3个100mL容量瓶中，用甲醇溶解后，定容至刻度。(2)标准溶液配制：根据实验需要，准确吸取一定量的储备液，分别配制成苯400μg·mL-1、甲苯400μg·mL-1、萘400μg·mL-1标准溶液。3.基线走稳后，分别注入苯、甲苯、萘的标准溶液20.0μL，记录各物质的色谱峰。记下各组分的保留时间和峰面积。4.注入待测样品溶液20.0μL，记下各组分的保留时间和峰面积。5.实验完毕，按要求关好仪器。五、结果与讨论1.根据保留值定性：同一物质，在同一色谱条件下，由于在色谱柱中的保留值是一定的，所以，出峰的时间也是一定的(仅适用于标准比较法)，因此可以利用保留时间进行定性。2.根据峰面积定量：在一定条件下，被测组分的浓度与检测器给出的响应信号(如峰面积、峰高)成正比。六、注意事项1.用注射器吸样时，不能有气泡。2.若用缓冲溶液作流动相，实验完毕，必须先用水充分清洗，再用甲醇充分清洗，防止盐析出会磨损泵头、堵塞输液管、进样阀、污染色谱柱、检测室等。七、思考题1.用作高效液相色谱流动相的溶剂使用前为什么要脱气2.色谱定性和定量分析的依据是什么3.外标法色谱定量的优点及实验中应注意哪些事项4.根据分离所得的色谱图，解释不同组分之间分离差别的原因。附录1LC-10ALC-10A高效液相色谱仪基本配置包括溶剂输送泵、检测器、色谱柱柱箱和数据处理装置等部件，以上部件与控制器相连。通过控制器可以统一控制这些组1.先开部件的电源，再打开系统控制器总电源，最后打开class-vp软件，选择PDA检测器，到达所需界面。有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。2.调节流量，选用合适的流速，走基线，观察基线的情况。3.调出方法文件或设立新方法，设定走样时间。标准溶液浓度标准峰面积试样峰面积试样浓度4.在菜单界面上按pump，然后，按instrumenton，接着按菜单选项control/previewrun（预览基线base），此时Ο亮。当基线比较稳定后（纵坐标高度几个mu，则可进样）。5.关掉preview，按Single-run，进入Single-runacquisition，输入sampleID，采集该数据的分析方法，Data（数据）保存路径，及Data名称，然后按start。此时状态显示栏显示Waitingfortrigger，可进样。用微量进样器吸取一定量的样品溶液(抽样后要排气泡)，将针管擦干,进样阀在inject状态下插入，旋至load状态，缓慢注入样液，快速转换回inject状态，随即按［START］键，分析工作开始，在inject状态下拔出微量进样器。6.系统开始分析试样。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。若要停止，可按界面的stop键（小红键）。7.全部样品走完后，将流动相换成水，进行充分清洗后，再用甲醇充分清洗。最后关闭输液泵、控制器及稳压器电源。8.整理实验台，认真如实填写实验记录。