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反相高效液相色谱法（HPLC）分析小鼠血清和组织中的视黄醇以及视黄基酯1.材料1.1。标准品的准备1.乙醇（ACS级）。2.视黄醇（Sigma）。3.视黄酯（Sigma）。4.维生素A棕榈酸酯（Sigma）。5.带帽棕色试剂瓶1.2。视黄醇的提取1.新鲜或冷冻的血清或组织（全部样品解剖后立即在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃。如果可能的话，从血清和组织萃取视黄醇必须“在黑暗中”迅速地进行，所有的提取步骤应在冰上或在冷室中进行。实验室窗户应覆盖合适的材料，如铝箔或厚重的窗帘（没有窗户的房间，是执行此过程的理想场所）。人工照明应在零售商店买黄色灯泡。另外，使用昏暗的灯光下，不要把样品直接暴露在灯光下，尽量减少光敏感视黄醇损失）。2.使用内标法所需要的内标物（视黄醇乙酸酯）。3.乙醇（ACS级）。4.己烷（HPLC级）。5.H2O（HPLC级）。6.PVDF过滤膜即聚偏二氟乙烯膜（0.22微米，47毫米）。7.全玻璃过滤装置。8.磷酸盐缓冲盐水（PBS），仅用于组织。9.N2气体，Evap-O-Rac系统（科尔-帕默）。10.PRO200手持式均质匀浆器，仅用于组织。11.巴斯德玻璃移液管（9英寸）和洗耳球。12.聚丙烯管（12毫米×75毫米）。13.玻璃试管（13毫米×100毫米16毫米×100毫米）。1.3。视黄醇的分析1.高效液相色谱法系统（本章中所提到的HPLC配件如棕色小瓶，进样瓶，瓶帽与戴安终极版3000系列高效液相色谱仪兼容。不同的HPLC系统可能还需要其他一些类型的配件）2．色谱柱（在我们的实验中，随着时间的推移，这个贝克曼色谱柱显示的结果具有重复性（包括保留期））3.保护柱4.棕色试剂瓶（本章中所提到的HPLC配件如棕色小瓶，进样瓶，瓶帽与戴安终极版3000系列高效液相色谱仪兼容。不同的HPLC系统可能还需要其他一些类型的配件）5.自动进样瓶（这个玻璃插入物通过一个弹簧塞进瓶里，弹簧对接触尖状物起缓冲作用。一旦完成样品的分析后，我们应该好好保存弹簧便于以后组装新的小瓶。）6.带有瓶盖的PTFE/硅隔膜（这些瓶盖和隔垫，可单独购买，(capw/osepta,NationalScientific,cat.no.C4000-98BLK;septa,NationalScientific,cat.no.C4000-60).）7.甲醇（HPLC级）。8.乙腈（HPLC级）。9.二氯甲烷（HPLC级）。2方法由于视黄醇的光敏性质，所有以下实验程序应该“在黑暗中”执行。（从血清和组织萃取视黄醇必须“在黑暗中”迅速地进行，所有的提取步骤应在冰上或在冷室中进行。实验室窗户应覆盖合适的材料，如铝箔或厚重的窗帘（没有窗户的房间，是执行此过程的理想场所）。人工照明应在零售商店买黄色灯泡。另外，使用昏暗的灯光下，不要把样品直接暴露在灯光下）2.1标准品的准备1.制备标准品储备溶液是将标准品溶解到适当的溶剂中，如下：乙醇溶解视黄醇及视黄醇酯;正己烷溶解维生素A棕榈酸酯。2.标准品储备液应该在棕色试剂瓶内制备并保存在-20°C。（高度浓缩的类视黄醇标准储备液即使储存在-20℃也会随时间降解。储备液推荐的最佳浓度约为1毫克/毫升。30毫升为原液的建议体积。根据上述方案制备储备液，在-20℃下，可以保持数月。）3.稀释每个标准溶液到约1纳克/微升。（稀释后的标准液都应保存在棕色小瓶。我们建议将稀释后的标准溶液分为小等分，每份3-4毫升。可以通过在盖上帽之前，用N2气体冲洗小瓶的顶部空间使降解或化合物的损失最小化。在用HPLC分析等分的稀释后的标准试样之前，要检查其质量）4.用分光光度计测量稀释后的标准溶液，吸光度为325纳米（使用1厘米宽的石英比色杯（1毫升））5.根据OD值和具体的消光系数计算各标准溶液的浓度（消光系数取决于该化合物和溶解的溶剂。视黄基醋酸酯溶解在乙醇中的消光系数是1550，视黄醇溶解在乙醇是1835，而维生素A棕榈酸酯溶解在乙醇是975）。6把稀释后的标准溶液分装在棕色小瓶中，并将它们储藏在-20℃下（稀释后的标准液都应保存在棕色小瓶。我们建议将稀释后的标准溶液分为小等分，每份3-4毫升。可以通过在盖上帽之前，用N2气体冲洗小瓶的顶部空间使降解或化合物的损失最小化。在用HPLC分析等分的稀释后的标准试样之前，要检查其质量）2．2。校准曲线的确定2.2.1。检测限度1.准备一系列不同稀释度的标准液（视黄醇，视黄酯，以及维生素A棕榈酸酯）。（检出限取决于探测器和色谱柱的使用情况。浓度范围的选择应根据所分析的组织的类视黄醇的含量。参见图15.1a为检测限曲线的一个典型的例子）2.将稀释液注入到HPLC柱。（如何操作HPLC系统将取决于仪器的类型，此程序的介绍对实验并没有什么作用。我们只建议监测色谱柱的压力和加样前目标波长的基线。各稀释样在在HPLC中都设置三个平行对照。注射量根据HPLC系统和/或使用的协定而变化。这个协定是：标准的注射量为二十微升）3.在UV吸光度为325nm处检测出的峰信号值，获得峰面积。形成以标准品的稀释度为x轴和相应的峰面积为y轴绘制标准曲线。（如图15.1a）2．2.2。标准曲线1.准备两个标准溶液，它们视黄醇-维生素A醋酸酯和维生素A棕榈酸酯-视黄酯的摩尔比不同，在HPLC中的棕色小瓶的含量如下：（在玻璃试管中加入适当体积的不同类视黄醇化合物（根据摩尔比）之后，在缓和的N2气流中干燥，然后重新悬浮于流动相中。涡旋良好立即转移到HPLC中棕色小瓶中。）视黄醇：视黄基醋酸酯（m:m）=0.1：1，0.25：1，0.5：1,1：1,2：1（视黄基醋酸酯浓度约为1毫微克/微升）维生素A棕榈酸酯：视黄基醋酸酯（m:m）=0.1：1，0.25：1，0.5：1,1：1,2：1,3：1，4：1,5：1（视黄基醋酸浓度约为2毫微克/微升）2.不同浓度的标准溶液注入的HPLC色谱柱。（如何操作HPLC系统将取决于仪器的类型，此程序的介绍对实验并没有什么作用。我们只建议监测色谱柱的压力和加样前目标波长的基线。各稀释样在在HPLC中都设置三个平行对照。注射量根据HPLC系统和/或使用的协定而变化。这个协定是：标准的注射量为二十微升）3.在UV吸光度为325nm处检测出的峰信号值，获得峰面积。以类维生素A混合物和内标准物的摩尔比为x轴，以相应的峰面积为y轴绘制标准曲线。（如图15.1b）2.3。视黄醇的提取2.3.1.血清中的提取1.添加100微升血清到玻璃试管中。2.加入25微升内标物视黄基醋酸酯，并添加乙醇，使用于提取的乙醇的总量和血清的总体积比值是1：1（例如，若用了150微升血清，那么在25μl的内标物中加入125μl乙醇）（内标物的建议浓度为1毫微克/微升。请注意，内标物溶于乙醇中，因此计算提取所需的乙醇的总体积应考虑在内）3.对试管简单的涡旋式震荡4.添加4毫升正己烷（一旦正己烷被加入，维生素A是稳定的。换句话说，提取过程必须迅速地进行，直到加入己烷），涡旋30秒两次（在此步骤中，应缓慢增加涡流的速度，以避免溶剂溢出。手持玻璃管一边。将手指放在该管的顶部可能导致杂质污染样品，混合时避免溶剂溢出）。5.以3000rpm在台式离心机低速离心3分钟。（在此离心之后，样品将分为两层：底层是水相，稍微混浊;顶部是含有类视黄酸的溶剂相的透明层。在这两个层之间和/或在管底部的接口，白色或彩色的小指组织残基允许存在）6.通过使用玻璃巴斯德吸管，转移上层相到含有500微升H2O中的一个新的玻璃试管中。7.对新的试管涡旋震荡8.重复步骤8并将上清液转移到一个含有玻璃巴斯德吸管的新的玻璃试管中。（在此离心之后，样品将分为两层：底层含有水，顶层含有溶剂。两层都清楚，无残留物。小心转移上层而不要触及下层）。9.在缓慢流动的N2中干燥上层液，通过Evap-O-Rac系统排放（科尔-帕默）。10.把样品溶解在50微升流动相中（这一步，应迅速进行，以避免样品蒸发。提前组装好HPLC小瓶（内置小瓶，瓶盖应使用隔膜等）。除了血清，大部分组织可轻易地再悬浮在流动相中。如果不是在这样的情况下，样品将出现浑浊，那就不应该注入HPLC柱。例如，脂肪组织，应重新悬浮在一种替代的溶剂中，如苯，流动相：苯（3:2，V:V）洗脱，乙腈），并转移到小瓶中便于注入HPLC柱。2.3.2。组织中的提取1.提取所需组织的重量将取决于其类视黄醇含量。为了说明步骤，我们将着重叙述肝内视黄醇的提取，推荐使用100毫克肝（对于脂肪，组织的提取量应小于50毫克。对于在14.5DPC（约200毫克）的胚胎，我们建议使用全胚胎和成人前列腺的整个器官（约40-50毫克））2.将100毫克肝放入含有2毫升PBS的聚丙烯管中。（不同体积的PBS应选择均化程度不同的组织，因为这些组织的类视黄醇含量不同。例如，1mlPBS，建议均化14.5DPC胚胎；2mlPBS，50毫克脂肪组织；1毫升PBS，成人前列腺）3.以中等速度10秒匀浆。（为了避免同质化步骤中的污染物，记得用干净的PBS仔细冲洗每个样品之间的探头）4.转移200μl的匀浆放入玻璃试管中。（肝脏是具有高浓度类视黄酸的组织。因此，我们建议，只有提取十分之一匀浆。然而，提取的最优的匀浆体积可能会有所不同，这取决于所述的类视黄醇含量组织。例如，从胚胎中进行类视黄醇的提取的情况下，建议使用进行萃取匀浆（1毫升）的全部（或一半）体积。我们也建议使用匀浆的全部体积来执行从脂肪（2毫升）或从前列腺（1毫升）中萃取）5.加入100微升内标醋酸视黄醇和100μl乙醇。（内标物的建议浓度为1毫微克/微升。请注意，内标物溶于乙醇中，因此计算提取所需的乙醇的总体积应考虑在内）6.对试管简单的涡旋式震荡7.按照提取的血清的第四步描述的步骤（所以不推荐从提前存储在-20℃下组织匀浆中提取类视黄醇，因为类视黄醇可能发生降解。新鲜烹制的组织匀浆是首选）2.4。高效液相色谱法（HPLC）分析（当组装注射进HPLC色谱柱的样品时，我们推荐设置一个空白对照（只用流动相），每隔5-6样品清理一次色谱柱中潜在的杂质）2.4.1。根据下面的表格准备流动相：（通过使用PVDF过滤膜用玻璃过滤器过滤流动相直到真空为止。此步骤有助于混合不同的溶剂和消除潜在的杂质。此外，流动相应置于超声发生器进行30分钟的脱气处理）乙腈70％甲醇15％二氯甲烷15％2.4.2。色谱条件色谱柱BeckmanUltrasphereC18（5微米），4.6毫米×250毫米保护柱C18（7微米），15mm×3.2毫米流速1.8毫升/分钟运行时间35分钟注射量20微升PDA检测波长325纳米2.4.3。确定类视黄醇的浓度-集成峰信号值在UV吸光度为325nm处检测，不同的视黄醇在色谱分离和鉴定时获得峰面积。呈现在HPLC峰值下视黄醇复合物的量将根据其峰下的面积来确定，使用如上所述生成的标准曲线方程。一个典型的肝脏类维生素a高效液相色谱色谱图如15.2所示。（为获得的峰面积，收集峰值信号可以自动地通过HPLC系统软件或手动执行。提取过程中的损失量是通过在提取前于样品中加入的已知量的内标物（视黄醇乙酸酯）测定的。维生素A棕榈酸酯和视黄基醋酸酯（m/m）产生的标准曲线将被用来计算视黄酯的不同分子种类的浓度。为获得最终视黄醇浓度，血清中提取的体积或提取vs所占匀浆总体积的百分比，总的匀浆体积也将被考虑到）图示见后一页