培养基和试剂的质控试卷

6培养基和试剂性能测试方法6.1生产商及实验室自制培养基和试剂的质量控制的测试方法GB4789.28—XXXX116.1.1非选择性分离和计数固体培养基的目标菌生长率定量测试方法6.1.1.1平板的制备与保存倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少3mm厚的琼脂层（直径90mm的平皿通常要加入18mL～20mL琼脂培养基），需添加试剂的培养基，应使培养基冷却至47℃～50℃后才添加试剂。倾注后将平板放到水平平面，使琼脂冷却凝固。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和(或)2℃～8℃冰箱的密封袋中，在有效期内使用。使用前应对琼脂表面进行干燥，但应注意不要过度干燥。6.1.1.2工作菌悬液的制备将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜或采用其他方法，制备10倍系列稀释的菌悬液。生长率测试常用每平板的接种水平为20CFU～200CFU。6.1.1.3接种选择合适稀释度的工作菌悬液0.1mL，均匀涂布接种于待测平板和参比平板。每一稀释度接种两个平板。可使用螺旋平板法(见附录F)或倾注法进行接种，并按标准规定的培养条件培养平板。6.1.1.4计算选择菌落数适中的平板进行计数，按下列式（1）计算生长率。PR=„„„„„„„„„„„„„„„（1）osNN式中：PR——生长率；NS——待测培养基平板上得到的菌落总数；N0——参比培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应≥100CFU）。参比培养基的选择：一般细菌采用TSA，一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖琼脂，对营养有特殊要求的微生物采用适合其生长的不含抑菌剂或抗生素的培养基。6.1.1.5结果解释目标菌在培养基上应呈现典型的生长。非选择性分离和计数固体培养基上目标菌的生长率应不小于0.7。6.1.2选择性分离和计数固体培养基的测试方法6.1.2.1目标菌生长率定量测试方法6.1.2.1.1平板的制备与保存按照6.1.1.1中要求进行。6.1.2.1.2工作菌悬液的制备按照6.1.1.2中要求进行。6.1.2.1.3接种按照6.1.1.3中要求进行。GB4789.28—XXXX126.1.2.1.4计算按照6.1.1.4中要求进行。6.1.2.1.5结果解释目标菌在培养基上应呈现典型的生长。选择性分离固体培养基上目标菌的生长率一般不小于0.5，最低应为0.1；选择性计数固体培养基上目标菌的生长率一般不小于0.7。参照附录F培养基质量控制标准。6.1.2.2非目标菌(选择性)半定量测试方法6.1.2.2.1平板的制备与保存按照6.1.1.1中要求进行。6.1.2.2.2工作菌悬液的制备将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜作为工作菌悬液。6.1.2.2.3接种用1μL接种环取选择性测试工作菌悬液1环，在待测培养基表面划六条平行直线（如图1），同时接种两个平板，划线时可在培养基下面放一个模板图，按标准规定的培养条件培养平板。操作时用接种环而不用接种针，接种环应完全浸入培养基中。取一满环接种物，将接种环接触容器边缘3次可去除多余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为20°～30°。接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续，移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。图1非目标菌半定量划线法接种模式图6.1.2.2.4计算培养后按以下方法对培养基计算生长指数G。每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上最多为6分。如果仅一半的线有稠密菌落生长，则G为0.5。如果划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G为0。记录每个平板的得分总和便得到G。同时接种两个平板。6.1.2.2.5结果解释GB4789.28—XXXX13非目标菌的生长指数G一般小于或等于1，至少应达到小于5。6.1.2.3非目标菌(特异性)定性测试方法6.1.2.3.1平板的制备与保存按照6.1.1.1中要求进行。6.1.2.3.2工作菌悬液的制备按照6.1.1.2中要求进行。6.1.2.3.3接种用1μL接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线。并按标准规定的培养条件培养平板。6.1.2.3.4结果解释非目标菌应有典型的菌落外观、大小和形态。6.1.3非选择性增菌培养基的半定量测试方法6.1.3.1培养基的制备将培养基分装试管，每管10mL。6.1.3.2工作菌悬液的制备将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜或采用其他制备方法，制备10倍系列稀释的菌悬液。6.1.3.3接种在装有待测培养基的试管中接种10CFU～100CFU的目标菌，每管接种量为1mL，接种两个平行管。同时将1mL菌悬液（与试管接种同一稀释度）倾注平板，接种两个平板，作接种量计数用。按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养（如增菌时间为8h以下，需取10μL培养后的增菌液倾注到适合的培养基中，再按适合的培养时间和温度进行培养）。6.1.3.4结果解释用目测的浊度值（如0～2）评估培养基：——0表示无混浊；——1表示很轻微的混浊；——2表示严重的混浊。目标菌的浊度值应为2。有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时，小心振荡试管后再进行观察。如增菌8h以下，10μL增菌液培养计数结果参照附录D培养基质量控制标准。6.1.4选择性增菌培养基的半定量测试方法6.1.4.1培养基的制备将培养基分装试管，每管10mL。6.1.4.2工作菌悬液的制备GB4789.28—XXXX14按照6.1.3.2中要求进行。6.1.4.3接种6.1.4.3.1混合菌的接种在装有待测培养基的试管中接种10CFU～100CFU的目标菌（特殊接菌量参照附录D培养基质量控制标准），并接种1000CFU～5000CFU的非目标菌，接种总量为1mL，同时接种两个平行管，混匀。同时分别将目标菌菌悬液（与试管接种同一稀释度）和非目标菌菌悬液（比试管接种小10～100倍稀释度）1mL倾注平板，接种两个平板，作接种量计数用。按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。6.1.4.3.2非目标菌的接种在装有待测培养基的试管中接种1000CFU～5000CFU的非目标菌，接种量为1mL，同时接种两个平行管，混匀。按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。6.1.4.4培养液的接种6.1.4.4.1混合菌培养液的接种用10μL接种环取1环经培养后的混合菌培养液，划线接种到特定的选择性平板上，同时每管接种一个平板。按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。6.1.4.4.2非目标菌培养液的接种吸取10μL经培养后的非目标菌培养液，均匀涂布接种到非选择性平板（如TSA）上。同时每管接种一个平板。可使用倾注法进行接种，并按标准规定的培养条件培养平板。6.1.4.5计算和结果解释目标菌在选择性平板上的菌落应10CFU，则表示待测液体培养基的生长率良好；非目标菌在非选择性平板上的菌落数应100CFU，则表示待测液体培养基的选择性为良好。6.1.5选择性液体计数培养基的半定量测试方法6.1.5.1培养基的制备将培养基分装试管，每管10mL。6.1.5.2工作菌悬液的制备按照6.1.3.2中要求进行。6.1.5.3接种6.1.5.3.1目标菌的接种在装有待测培养基的试管中接种10CFU～100CFU的目标菌，接种总量为1mL，同时接种两个平行管，混匀。同时将1mL菌悬液(与试管接种同一稀释度)倾注平板，接种两个平板，作接种量计数用。按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。6.1.5.3.2非目标菌的接种在装有待测培养基的试管中接种1000CFU～5000CFU的非目标菌，接种总量为1mL，同时接种GB4789.28—XXXX15两个平行管，混匀。同时将1mL菌悬液(比试管接种小10～100倍稀释度)倾注平板，接种两个平板，作接种量计数用。按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。6.1.5.4结果解释用目测的浊度值(如0～2)评估培养基：——0表示无混浊；——1表示很轻微的混浊；——2表示严重的混浊。并记录小导管收集气体的体积比。目标菌的浊度值应为2，产气应为1/3或以上；非目标菌的浊度值应为0或1，无产气现象。注：有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时，小心振荡试管后再进行观察。6.1.6悬浮培养基和运输培养基的定量测试方法6.1.6.1培养基的制备将培养基分装试管，每管10mL(有特殊要求的可选用5mL)。6.1.6.2目标菌工作菌悬液的制备按照6.1.3.2中要求进行。6.1.6.3接种在装有待测培养基的试管中接种100CFU～1000CFU的目标菌，同时接种两个平行管，混匀后，立即吸取1mL待测培养基混合液，参照附录F培养基质量控制标准选用相应的培养基倾注平板，每管待测培养基接种一个平板。按标准方法中规定的培养时间和温度培养后，进行菌落计数。剩余已接种菌液的待测培养基置20℃～25℃放置45min后；再吸取1mL倾注平板，每管培养基接种一个平板，按标准方法中规定的培养时间和温度培养后，进行菌落计数。如保存条件有特殊要求的待测培养基，参照附录F培养基质量控制标准要求放置或培养后再进行菌落计数。6.1.6.4结果观察与解释待测培养基中的菌落数变化应在±50%内。6.1.7Mueller-Hinton血琼脂的纸片扩散测试方法（定性测试方法）6.1.7.1平板的制备与保存倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个厚度为4mm～5mm的琼脂层。倾注后将平板放到水平平面，使琼脂冷却凝固。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）5℃±3℃冰箱的密封袋中，在有效期内使用。使用前应可将平板置35℃温箱中或置室温层流橱中对琼脂表面进行干燥，培养基表面应湿润，但不能有水滴，培养皿也不应有水滴。6.1.7.2质控菌株的复苏将质控菌株接种到血平板上，按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。检查纯度合格后，用于质控工作菌悬液的制备。6.1.7.3质控菌工作菌悬液的制备GB4789.28—XXXX16将纯度满意的质控菌株培养物悬浮于TSB肉汤中，并调整浊度为0.5麦氏标准（约1×108CFU/mL～2×108CFU/mL）。6.1.7.4接种用涂布法将质控工作菌悬液接种于MH平板上，并贴上相应的抗生素纸片(每平板最多贴6片)，将平板翻转后按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。调整菌悬液浊度与接种所有平板间的时间间隔不要超过15min。6.1.7.5结果观察与解释在无反射黑色背景下，观察有无抑菌环。结果解释参照参照附录D表D.7。6.1.8鉴定培养基的测试方法6.1.8.1液体培养基6.1.8.1.1培养基的制备将培养基分装试管，再进行灭菌和添加试剂。6.1.8.1.2工作菌悬液的制备将标准储备菌株接种到非选择性肉汤中或采用其他制备方法，制备成5McFarland浊度（约109CFU/mL）的菌悬液。6.1.8.1.3接种吸取0.05mL～0.08mL（约1～2滴）至待测培养基内，按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。6.1.8.1.4结果观察与解释需加指示剂的试验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，再观察结果。结果解释参照附录D表D.8。6.1.8.2半固体培养基6.1.8.2.1培养基的制备将培养基分装试管。灭菌后竖立放置，冷却后备用。6.1.8.2.2接种取新鲜质控菌株斜面，用接种针挑取菌苔穿刺接种至待测培养基内。按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养。6.1.8.2.3结果观察与解释需加指示剂的试验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，再观察结果。结果解释参照附录D表D.8。6.1.8.3高层斜面培养基和斜面培养基6.1.8.3.1培养基的制备GB4789.28—XXXX17将培养基分装试管。灭菌后摆放成高层斜面（斜面与底层高度约为2:3）和普通斜面（斜面与底层高度约为3:2），冷却后备用。6.1.8.3.2接种高层斜面培养基：取新鲜质控菌株斜面，用接种针挑取菌苔穿刺接种至琼脂高层，穿刺接种完毕后，再在斜面上划“之”字形接种；斜面培养基