培养基对尖孢镰刀菌281菌株产孢量的影响(

培养基对尖孢镰刀菌281菌株产孢量的影响蓝江林1，肖荣凤1，朱育菁1，杨淑佳2，葛慈斌1，刘波1，焦会民3（1.福建省农业科学院生物技术研究所，福州350003；2.厦门大学生命科学院，厦门360012；3.福建农林大学植保学院，福州350002）摘要：选择8种培养基培养尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)281号菌株，培养144h，在PDA培养基上得到最大产孢量128.3×107cfu/ml，与其它培养基产孢量差异显著。VBC培养基培养，产孢量没有没有明显的增加。综合比较8种培养基，PDA培养基是较为理想的产孢培养基。关键词：培养基，尖孢镰刀菌，产孢量EffectsofMediumonSporificationofFusariumoxysporumSchl.LanJianglin1，XiaoRongfeng1，ZhuYujing1，YangShujia2，GeCibin1，LiuBo1*，JiaoHuimin3(1.BiotechnologyResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003；2.SchoolofLifeSciences,XianmenUniversity,Xiamen361005；3.PlantProtectionCollege，FujianAgricultureanForestryUniversity，Fuzhou350002)Abstract:TheresultsofeightmediemseffectonsporificationofwiltpathogenFusariumoxysporum281showedthatthenumberofsporificationis128.3×107cfu/mlinPDAmediumafter144h,SignificantdifferencewereobservedbetweenPDAmediumandothers.Keywords:medium,FusariumoxysporumSchl.，Sporification尖孢镰刀菌可以引起农作物枯萎病，是毁灭性的土传病害，造成损失平均高达20-80%。黄瓜枯萎病的防治目前主要采用以抗病品种为主的综合防治措施，但抗病种种植多年后要退化，必须不断选育新的抗病品种，因而，生物防治方法引起许多学者的注意。近年来，黄瓜枯萎病生物防治的研究取得了一些进展，但还未见在生产上有大面积推广应用的生防菌剂。真菌制剂主要是通过子实体——小孢子感染靶标有害生物，使寄主感病致死，从而达到防治目的。筛选配方简单，价格便宜，原料易得，产孢量多的培养基，是真菌微生物制剂研究中首先必须解决的问题之一。1材料与方法1.1试验材料菌株：尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)281号菌株[1]，分离自发病植株根部土壤。福建省农业科学院生物技术研究所生物农药研究中心菌种库提供。培养基：共选择真菌培养基8种。（1）CYM培养基；（2）PDA培养基；（3）VBC培养基；（4）马铃薯牛肉膏培养基；（5）ATCC5培养基；（6）BPY培养基；（7）TYG培养基；（8）燕麦片培养收稿日期：基金项目：国家863项目（2006AA10A211）；福建省自然科学基金(2006J0068)；福建省发改委重点项目(闽发改投资[2006]781号)。作者简介：蓝江林（1972-），副研究员。通讯作者：刘波，从事生物技术和生物防治研究，E-mail：[e-mail]。基。1.2试验方法[2]1.2.1培养基配制（1）CYM培养基：蛋白胨2g、酵母膏2g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1.0g，蒸馏水加至1000ml。（2）PDA培养基：马铃薯汁1000ml、葡萄糖20g。（3）VBC培养基：KH2PO41g、KNO31g、蔗糖0.5g，维生素复B1片，维生素C1片，蒸馏水1000ml。（4）马铃薯牛肉膏培养基：麦芽糖20.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨3.0g、马铃薯200.0g，pH7.0-7.2。（5）ATCC5培养基：酵母膏1.0g、牛肉膏1.0g、胰蛋白胨2.0g、葡萄糖10.0g、FeSO4微量、琼脂15.0g、蒸馏水1000ml，pH7.2。（6）BPY培养基：牛肉膏5.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、蒸馏水1000ml，pH7.2。（7）TYG培养基：胰蛋白胨3.0g、酵母膏3.0g、葡萄糖3.0g、K2HPO41.0g、蒸馏水1000ml，pH7.4。（8）燕麦片培养基：燕麦片60.0g、蒸馏水1000ml。将燕麦片加600ml水中，制成匀浆，加热至45-50℃，然后加入400ml水，121℃灭菌90分钟。1.2.2尖孢镰刀菌281号菌株的培养采用液体培养法，250ml三角瓶，每瓶装瓶量为100ml，每种培养基接种3瓶，接种量为6.01×109cfu/ml菌液1ml，25℃、150rpm、黑暗条件下培养。每48h取样，采用血球计数板统计小孢子数量，共培养10天，取样5次。在10×40倍显微镜下用血球计数板测定小孢子浓度，作为产孢量评价指标。1.3数据处理[3]所有数据的整理和分析均用微软的Excel2000软件以及DPS数据处理软件进行（唐启义和冯明光，2002)。2结果与分析2.1尖孢镰刀菌小孢子形态尖孢镰刀菌小孢子形态见图1。图1尖孢镰刀菌小孢子形态（PDA培养基）2.2各种培养基小孢子数量达到最大的培养时间实验结果见表1、图2。在选择的培养时间内，各种培养基小孢子数量达到最大值的时间均有所不同。CYM培养基培养192h，小孢子数量达到最高47.67×107cfu/ml；PDA培养基培养至144h，小孢子数量达到最高128.3×107cfu/ml；VBC培养基在整个培养过程中小孢子的数量始终较低，培养至240h,小孢子数量达到最多，为0.87×107cfu/ml；马铃薯牛肉膏培养基培养至240h时，小孢子数量达到最高，为67.5×107cfu/ml；ATCC培养基培养至192h，小孢子数量最高达132.5×107cfu/ml；BPY培养基培养至144h，小孢子数量达到最多34.67×107cfu/ml；TYG培养基培养48h，小孢子数量最多达43.58×107cfu/ml；燕麦培养基培养至240h，小孢子数量达到最多20.3×107cfu/ml。表1尖孢镰刀菌281号菌株产孢培养基产孢数量编号培养基小孢子数量（×107cfu/ml）48h96h144h192h2401CYM9.743.8330.3247.6731.502PDA21.9229.75128.3087.5045.003VBC0.230.610.850.710.874马铃薯牛肉膏30.7543.7519.3929.3367.505ATCC2.0850.0823.83132.517.176BPY6.0015.2534.6726.8313.007TYG3.5043.5819.0035.5024.678燕麦2.926.084.987.8320.300204060801001201404896144192240时间（h）孢子数（×107cfu/ml）CYMPDAVBC马铃薯牛肉膏ATCCBPYTYG燕麦图2尖孢镰刀菌281号菌株在不同培养基上的产孢量2.3各种培养基小孢子数量的差异实验结果见表2、图3。培养至96h时，各培养基小孢子产量增长不大，且彼此间没有显著差异。培养至144h，不同培养基产生小孢子的数量出现明显差异。其中PDA产生的小孢子数量最多，达到128.30×107cfu/ml，是培养起始浓度的21.35倍，与其它培养基之间差异显著（P=0.05）；其次是CYM、马铃薯牛肉膏培养基、ATCC、BPY、TYG和燕麦培养基，产生的小孢子数量较少；VBC培养基产生小孢子数量最少，仅为0.85×107cfu/ml，与其它培养基之间差异显著（P=0.05）。培养至192h时，ATCC培养基的小孢子数量达到132.5×107cfu/ml，与PDA培养基之间无显著差异（P=0.05），与CYM培养基、VBC培养基、马铃薯牛肉膏培养基、BPY培养基、TYG培养基和燕麦片培养基产孢量差异显著（P=0.05）。表2不同培养基小孢子数量编号12345678培养基CYMPDAVBC马铃薯牛肉膏ATCCBPYTYG燕麦144h小孢子数量（×107cfu/ml）30.32128.300.8519.3923.8334.6719.004.98P=0.05ababababababab196h小孢子数量（×107cfu/ml）47.6787.500.7129.33132.526.8335.507.83P=0.05bcabcbcabcbcc-20020406080100120140160CYMPDAVBC马铃薯牛肉膏ATCCBPYTYG燕麦培养基孢子浓度（（×107cfu/ml））图3不同培养基小孢子数量（144h）3结论与讨论在选择的8种培养基中，PDA培养基和ATCC培养基的小孢子数量最多。PDA培养基144h达到最大小孢子量128.30×107cfu/ml，ATCC培养基在192h达到最大小孢子量132.5×107cfu/ml，均远高于其它6种培养基。综合比较来看，PDA培养基的小孢子数量略低于ATCC培养基的小孢子数量，但基本可以满足试验要求，且培养的时间较ATCC要少48h，原材料易得，配制方法简单，是真菌培养使用的传统培养基，应该是理想的选择。王拱辰[3]等研究表明，VBC固体培养基能促进多数镰刀菌产生大孢子，产孢量可达3×105cfu/ml。本试验采用的VBC液体培养基，培养至144h，小孢子数量达0.85×107cfu/ml，培养至240h，小孢子数量达到最高0.87×107cfu/ml，整个观察过程少见大孢子和菌丝出现，。在其它的培养基中生长也同样如此，说明试验所选的8种培养基较适合于小孢子的生长，产量以PDA和ATCC培养基高。参考文献[1]魏景超．真菌鉴定手册[M]．上海：上海科学技术出版社，1979．581．[2]方中达．植病研究方法(第三版)[M]．1998．北京：农业出版社，37—155．[3]唐启义，冯明光．实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]．2002．北京：科学出版社，174-184.[4]王拱辰，陈辉珍．促进镰刀菌产孢的培养基．植物病理学报[J]．1995，25（2）：165-166．