培养基有效期的验证方案-2

文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:1of15培养基有效期的确认本方案已由下列人员审查并批准文件责任职位签字日期报告者审核者审核者批准者文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:2of151.目的：确定日常环境监控、微生物限度检测使用培养基的有效期。2.接受标准:2.1试验用菌悬液每1ml含菌数应小于100cfu。2.2培养基配制后无菌性检查和营养性检查需符合要求。2.3培养基的pH值应符合相应培养基的要求。3.操作程序：3.1实验仪器及器具：生化培养箱LRH-250A（广东省医疗器械厂，30-35℃,23-28℃,20-25℃）；XG1.DMX-0.36B型脉动真空灭菌器（山东医疗器械股份有限公司编号10.0311）；FE20型pH计（梅特勒）；灭菌生理盐水；移液管；试管；双碟。3.2验证培养基：硫乙醇酸盐流体培养基TGB(德国merk)，大豆酪蛋白消化肉汤培养基TSB(德国merk)，营养琼脂培养基NA(德国merk)，萨布罗葡萄糖琼脂培养基SDA(德国merk)、平板计数培养基PCA(德国merk)、远腾琼脂培养基ENA(德国merk)、硫酸月桂醇肉汤LST(德国merk)、亮绿乳糖肉汤培养基BGLBB(德国merk)、麦康凯琼脂培养基Mac.A(德国merk)、大豆酪蛋白消化琼脂培养基TSA(德国merk)、假单胞菌分离琼脂培养基PIA(BD)、绿脓荧光素测定用培养基PAF(德国merk)、绿脓菌素测定用培养基PAP(德国merk)、甘露醇胆盐琼脂培养基(MSA)(德国merk)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET）(德国merk)、沙门氏菌增菌培养基(RVSB)(德国merk)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂XLD(德国merk)、麦康凯肉汤培养基Mac.B(德国merk)、曙红亚甲蓝琼脂培养基EMB(德国merk)、三糖铁琼脂TSI(德国merk)、萨布罗葡萄糖肉汤培养基SDB(德国merk)、梭菌增菌培养基RCM(德国merk)、哥伦比亚琼脂培养基CA(德国merk)、肠肝菌增菌培养基EEB-M(德国merk)、紫红胆汁葡萄糖培养基VRBGA(德国merk)3.3试验菌:金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus[ATCC6538]大肠埃希菌Escherichiacoli[ATCC8739]沙门氏菌Salmonellatyphimurium[ATCC14028]铜绿假单孢菌Pseudomonasaeruginosa[ATCC9027]枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[ATCC6633]文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:3of15生孢梭菌Clostridiumsporogenes[ATCC19404]白色念珠菌Candidaalbicans[ATCC10231]黑曲霉Aspergillusniger[ATCC16404]3.4菌悬液的制备：3.4.1各取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，30-35℃培养24-48小时，其中生孢梭菌需厌氧培养，取出置2－8℃贮存使用7天，每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约为10－100cfu/ml。3.4.2取白色念珠菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，20-25℃培养48-72小时，取出置2－8℃贮存使用7天。取黑曲霉菌SDA斜面培养物用灭菌生理盐水洗脱孢子，置2－8℃贮存使用7天。每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约10－100cfu/ml。3.4.3菌悬液计数3.4.3.1无菌操作吸取菌悬液1ml，加入含灭菌稀释剂100ml的三角瓶中，摇匀成10-2稀释液，同样操作制备10-4和10-6稀释液（必要时也可作更大倍数稀释）。3.4.3.2每种菌悬液备好二只灭菌双碟和融化好并放至50℃的NA培养基和RNA培养基TSA培养基和SDA培养基。3.4.3.3向双碟内注入10-6稀释液（必要时可以是其它浓度稀释液）1ml。3.4.3.4向含稀释液的双碟内加入备好的培养基约20ml，迅速振摇混合稀释液和培养基，并放置使凝固成平板，其中生孢梭菌置于厌养袋中。3.4.3.5翻转双碟置适宜温度培养(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌30-35℃培养24-48小时，白色念珠菌和黑曲霉菌20-25℃分别培养2-3天和3-5天)。3.4.3.6计数平板上的菌落数求出平均值，得到稀释液的菌浓度要求应为含菌10-100cfu/ml，若不在此范围内可以改变稀释倍数，得到含菌符合要求的稀释液。3.5实验步骤3.5.1培养基的制备3.5.1.1硫乙醇酸盐流体培养基（TGB）酪胨（胰酶水解）15.0g葡萄糖5.0g文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:4of15L-胱氨酸0.5g硫乙醇酸钠0.5g或硫乙醇酸0.3ml新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml酵母浸出粉5.0g氯化钠2.5g琼脂0.7g纯化水1000ml用1N氢氧化钠或1N盐酸调节pH值，使灭菌后为7.1±0.2，分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121℃高压灭菌15分钟，备用。使用前，培养基氧化层的颜色（粉红色）不得超过培养基深度的1/5。否则，须经100C水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。3.5.1.2大豆酪蛋白消化肉汤培养基(TSB)胰酪胨15.0g大豆胨5.0g氯化钠5.0g纯化水1000ml用1N氢氧化钠或1N盐酸调节pH值，使其灭菌后pH7.3±0.2,分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121℃高压灭菌15分钟，备用。3.5.1.3营养琼脂培养基(NA)胨5.0g肉浸出粉3.0g琼脂12.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸至完全溶解，用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH值，使其灭菌后pH为7.0±0.2，置121℃高压灭菌15分钟，备用。3.5.1.4萨布罗葡萄糖琼脂培养基：(SDA)葡萄糖40.0g文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:5of15胨（肉和酪蛋白）10.0g琼脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为5.6±0.2，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌前加入氯霉素50mg/L。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.5平板计数培养基：(PCA)胰酶消化酪蛋白5.0g酵母膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.0±0.2，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.6远腾琼脂培养基：(ENA)蛋白胨10.0g磷酸氢二钾2.5g无水亚硫酸钠3.3g乳糖10.0g阿拉伯胶0.3g琼脂12.5g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.1±0.2，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.7硫酸月桂醇肉汤（LST）胰蛋白20.0g文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:6of15乳糖5.0g氯化钠5.0g硫酸月桂醇钠0.1g磷酸氢二钾5.0g磷酸二氢钾1.0g蛋白胨10.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为6.8±0.2，加热煮沸1min，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.8亮绿乳糖肉汤培养基（BGLBB）蛋白胨10.0g乳糖10.0g干牛胆20.0g亮绿0.0133g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为6.8±0.2，加热煮沸1min，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.9麦康凯琼脂培养基(Mac.A)胰酶消化明胶17.0g蛋白胨3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐混合物1.5g琼脂13.5g中性红30mg结晶紫1.0mg文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:7of15纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸1min，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.1±0.2，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.10大豆酪蛋白消化琼脂培养基：(TSA)胰酶消化酪蛋白15.0g番木瓜酶消化大豆5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,加热煮沸至完全溶解,冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使其灭菌后pH7.3±0.2，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.11假单胞菌分离琼脂培养基（PIA）蛋白胨20.0g氯化镁1.4g硫酸钾10.0g氯苯酚0.025g琼脂13.6g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使灭菌后为7.0±0.2，置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.12绿脓荧光素测定用培养基(PAF)胰酶消化酪蛋白10.0g动物组织胃蛋白消化酶10.0g无水磷酸二氢钾1.5g硫酸镁(MgSO3.6H2O)1.5g文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:8of15甘油10.0ml琼脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.2±0.2。置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.13绿脓菌素测定用培养基(PAP)胰酶消化明胶20.0g无水氯化镁1.4g无水磷酸二氢钾10.0g琼脂15.0g甘油10.0ml纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.2±0.2。置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.5.1.14甘露醇胆盐琼脂培养基(MSA)胰酶消化酪蛋白5.0g动物组织胃蛋白消化酶5.0g牛肉膏1.0gD-甘露醇10.0g氯化钠75.0g琼脂20.0g酚红0.025g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后的为7.4±0.2。置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。文件名：培养基有效期的确认确认方案文件编号:FASP-MD-QC-01页号:9of153.5.1.15溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET）胰酶消化明胶20.0g氯化镁1.4g硫酸钾10.0g琼脂13.6g西曲溴铵0.3g甘油10.0ml纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中,在振摇下加热煮沸1分钟，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH，使在灭菌后为7.2±0.2。置121℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。3.