培养条件对大肠杆菌的影响

山东职业学院毕业论文题目：浅析培养条件对大肠杆菌的生长和rhG-CSF表达的影响系部：生物工程系专业：生物技术及应用班级：生物技术及应用0931班姓名：学号：指导教师：2012年03月30山东职业学院山东职业学院毕业设计（论文）任务书班级学生姓名指导教师设计（论文）题目浅析培养条件对大肠杆菌的生长和和rhG-CSF表达的影响主要研究内容培养条件对大肠杆菌的生长和rhG-CSF表达的影响。主要从温度，PH值，溶解氧，接种量，培养时间，摇床的转速，工程菌生长时间机诱导时间的对照实验，来研究大肠杆菌的生长和表达的条件。根据研究的结论，进一步分析大肠杆菌在生物药品生产中的应用最佳条件。主要技术指标或研究目标借鉴了大量的著名专家的文献，以文献的知识为主线。严格每一步的操作。逐一研究大肠杆菌的生活条件，对照实验结果，得出更严谨的数据。通过试验得到利于大肠杆菌生长的营养环境和rhG-CSF表达的最佳环境条件，用来提高大肠杆菌工程菌生长和目标蛋白表达，进一步的缩短生产周期，降低生产成本，为大肠杆菌表达的目的蛋白大规模生产奠定最坚实的基础。基本要求严格根据实验步骤合理安排实验,每个实验都设立3个对照,使实验结果更具有说服力，真实可行。主要参考资料及文献[1]杨炜，王伟刚，田海英，等．重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究[J]．生物技术2006[2]郑大勇，罗荣城．蔡红兵．基因工程抗体anti?HBsAgFab原核表达体系大规模培养条件的实验研究[J]．第一军医大学学报，2004[3]霍向东，石玉瑚．大肠杆菌高密度发酵补料调控策略的研究进展[J]．新疆农业科学。2004[4]张嗣良．发酵过程多水平问题及其生物反应器装置技术研究,基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技术[J]．中国工程科学．2001山东职业学院目录1前言·······························-3-1.1简述································12材料与方法····························12.1菌种························错误!未定义书签。2.2试剂································22.3培养基及组成成分添加························22.4培养方法······························22.4.1摇瓶发酵·····························32.4.2种子罐培养····························33培养条件对工程菌的生长和rhG-CSF表达的影响······33.1培养温度······························33.2PH值································33.3溶解氧·······························33.4接种量·······························33.5培养时间······························43.6转速································43.7工程菌的生长时间及诱导时机·····················44OD值的测定····················错误!未定义书签。5结果与分析····························45.1培养温度的测定···························45.2PH值的测定·····························45.3溶氧量对菌体生长的影响·······················55.4接种量的影响····························55.5培养时间的测定···························55.6转速的测定·····························55.7工程菌的生长曲线及诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响错误!未定义书签。6小结与讨论····························5参考文献································7山东职业学院谢辞··································7摘要利用大肠杆菌生产药品是一种生物方法：即利用生物工程技术将外源基因转入大肠杆菌中，经过发酵培养使之表达，经过离心收集菌体，再用特定的溶液使菌体破碎后收集目的蛋白，在经过后续的一些处理制成药品。从菌种选择方面进行研究。工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种，基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。为了提高大肠杆菌工程菌生长和目标蛋白表达，缩短生产周期，降低生产成本，进行了单因子试验。试验分别从培养温度、pH值、溶解氧、接种量、培养时间、转数、诱导时机等方面对rhG-CSF表达的影响进行了逐一研究。通过试验我们得到了大肠杆菌在10L发酵罐培养的最佳营养条件和最佳环境条件。通过试验得出的结果培养大肠杆菌，在不同时间段测其OD600nm值，得出最佳诱导时机。利用得到的结果，结合药品GMP原则，从而得到了大肠杆菌工业化生产工艺，为大肠杆菌表达的目的蛋白大规模生产奠定基础。关键词：大肠杆菌；发酵；目的蛋白山东职业学院11前言1.1简述大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)为革兰氏阴性短杆菌，又称肠埃希氏菌。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。主要生活在大肠内。培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。它的基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个环状质粒DNA。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料。大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。大肠杆菌细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。作为外源基因表达的宿主，大肠杆菌遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，繁殖迅速，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系，是生物学上重要的实验材料。1.2重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF），是应用基因重组工程技术制成的一种蛋白质，作为粒系祖细胞及成熟中性粒细胞表面的特异性受体结合，促进前者的增殖分化并增强后者的功能(包括趋化性、吞噬和杀伤功能等)。本蛋白还可促进髓系造血祖细胞的增殖、分化和成熟，调节中性粒细胞系的增殖与分化成熟；也可驱使中性粒细胞释放至血流，使外周中性粒细胞数量增多。山东职业学院2rhG-CSF为Ⅱ类造血刺激因子，有细胞系特异性，仅作用于中性粒细胞及其祖细胞。适用治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，较大剂量也可用于骨髓增生异常综合征，与再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症。2材料与方法2.1菌种处于安全考虑，工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株失去了细胞壁的重要组分，在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。发酵用菌种的筛选:用LB液体培养基铺平皿,接种,30℃培养18h,挑单菌落接种于含5mlLB培养基(50μg/ml氨卞西林钠)的试管中,30℃培养至OD600nm为0.4-0.6,升温至42℃,培养3h,离心收集菌体,SDS-PAGE检测,选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种。基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。2.2试剂氯化钠、氢氧化钠、工业消泡剂、甘油、硫酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、无水硫酸镁、酵母粉和蛋白胨、琼脂等。2.3培养基及组成成分添加发酵大肠杆菌所需培养基包括种子罐培养基,发酵罐培养基（以种子培养基为基质,再添加适量营养成分、无机盐和微量元素）。微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。每1L配制好的微量元素溶液中含有FeCl3·6H2O3.24g,ZnCl20.22g,CoCl2·6H2O0.24g,NaMoO4·2H2O0.24g,CaCl2·2H2O0.12g,CuSO4·5H2O0.20g,H3BO31.00g,MgSO40.74g及62mLw=38%的盐酸溶液。取130μL上述微量元素溶液及4μL25g/L的维生素溶液,将其一起加入到100mL的培养基中。2.4培养方法我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌。准确称取各成分。配置LB固体培养基时还需要加入琼脂。在250ml三角瓶和500ml山东职业学院3三角瓶中分别装入30ml和230mlLB液体培养基。将三角瓶用6层纱布包住瓶口，再用牛皮纸包好，放入灭菌柜内，121℃液体程序灭菌20min。2.4.1摇瓶发酵将在-70℃的甘油管中冻存的基因工程菌（大肠杆菌）菌种接种于装有LB液体培养基的250ml三角瓶中,所有培养基均含氨苄西林钠(Amp)0.1g/mL。将培养液在37.5℃,200r/min的摇床条件下培养17-18小时,取出，放于洁净密闭工作台中。手消毒后点燃酒精灯，于工作台中吸取2mL菌液，再接种于装有230mlLB液体培养基的500mL三角瓶中。将培养液放入摇床中培养，培养至菌体光密度达到所需要求后,将其作为一级种子。2.4.2种子罐培养将一级种子接种于10L种子罐培养基(含Amp0.1g/mL)中，通气量为50L/min,搅拌速度为200-1000r/min,当培养至菌体光密度达到所需要求时,升温至42℃,诱导表达一定时间。发酵中加入一定比例的工业消泡剂消除泡沫，以防泡沫过多，影响发酵。在接种前取样一次,并将此样品作为比色测定的参比溶液。接种后每隔30min取样一次,测菌体光密度,最后取2mL发酵终止液进行离心,测定菌体光密度、菌体湿重、菌体干重和rhG-CSF的表达量。3培养条件对工程菌的生长和rhG-CSF表达的影响3.1培养温度在LB液体培养基中，按4％的接种量，30～40℃，200r／min，溶氧量50％，在pH7.5的培养基中培养18h，取菌液测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.2pH值以35mol／L的Na2HPO4-NaH2PO4为缓冲液，将培养基分别调至pH6.0～8.5，4％的接种量，37.5℃，200r／min，溶氧量50％，培养18h后测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.3溶解氧按照4％接种量接人液体大肠杆菌种子液，37.5℃，200r／min，在pH7.5的培养基中培养，并以不同的通气量，使溶氧指数达到20％、30％、40％、50％、60％、70%，18h后取菌液测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.4接种量按照不同的接种量1％、2％、3％、4％、5％，接种于10L发酵罐中，在37.5℃，山东职业学院4200r／min，溶氧量50％，pH7.5的培养基中培养，18h取菌液测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.5培养时间按4％接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中，37.5℃，在培养过程中自动控制pH7.5，溶氧量50％，200r／min，培养10h后每隔2h测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.6转速按4％接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中，在100～300r／min，自动控制pH7.5，溶氧量50％，pH7.5的培养基中培养，37.5℃培养18h后测定菌体密度。每个处理设3个重复。3.7工程菌的生长时间及诱导时机在选定的发酵罐