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实验三产淀粉酶培养条件的优化一．实验目的掌握发酵工艺参数的单因素优化实验设计和操作方法。二．原理在工业化发酵生产中，培养条件的设计是十分重要的，因为培养基的成分和培养条件对菌体生长和产物浓度都有重要的影响。单因素方法的基本原理是保持培养基组分和培养条件中其余参数不变，每次只研究一个参数的不同水平对发酵过程的影响。这种策略的优点是简单易操作，结果明了而不需要统计分析。这种策略的主要缺点是：忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；不能考察因素的主次关系；当考察的实验因素较多时，需要大量的实验和较长的实验周期。三．材料与仪器1.活材料出发菌株选取复筛实验中酶活最高的一株。2.器材三角瓶、容量瓶、吸管、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、电磁炉、接种环、酒精灯、无菌操作台、灭菌锅和恒温振荡培养箱。四．方法与步骤1.摇瓶培养基的配制1)种子培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，NaCl5g，加蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0，每瓶装20mL培养基，121℃灭菌20min备用。2)基础发酵培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母膏3g，加蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0。3)发酵培养基：每组进行相应序号的实验，每个水平重复2瓶，碳氮源培养基分开灭菌，碳源部分为可溶性淀粉（或其余替代碳源），每个试管装液15mL，其余组分为氮源部分，每瓶装液体培养基35mL，121℃灭菌20min备用。2.接种从保存的甘油管中取50μL菌液，转接至装有种子培养基的三角瓶中培养24小时，培养温度37℃，摇床转速200rpm。24小时后以4%接种量，转接至装有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养24h，培养温度37℃，摇床转速200rpm。3.离心取发酵液1mL于高速离心机12000rpm离心10min，取上清即为粗酶液。4.发酵液菌体浓度的测定取发酵液稀释适当倍数后，于600nm波长测定菌体浓度OD值。5.淀粉酶活力的测定比色法测定淀粉酶的活力。6.活细胞染色镜检取细胞培养液样品，稀释适当倍数后涂片固定，以结晶紫染色剂染色，在显微镜下观察菌体形态。五．结果与讨论六．思考题本组实验中测得的淀粉酶活力，实验误差主要来源于哪些因素?附注：本实验中，第一、二组进行碳源种类的优化，将基础发酵培养基中的淀粉分别替换为蔗糖、葡萄糖、柠檬酸和乳糖，以可溶性淀粉为对照组；第三、四组进行氮源种类的优化，将基础发酵培养基中的蛋白胨分别替换为牛肉膏、硫酸铵、豆饼粉和鱼粉，以蛋白胨为对照组；第五组进行氮源浓度的优化，将基础培养基中的蛋白胨和酵母抽提物浓度分别改为1g/L和0.3g/L、5g/L和1.5g/L、30g/L和9g/L，以10g/L蛋白胨和3g/L酵母抽提物为对照组；第六、七组进行微量元素优化，分别在基础发酵培养基中加入CuSO450μmol/L、MnCl2100μmol/L、ZnSO4100μmol/L、Fe2(SO4)3100μmol/L和CoSO4·7H2O100μmol/L，以不添加微量元素为对照组；第八、九组进行碳氮比优化，将基础培养基中的酵母提取物添加量降为1g/L，再将淀粉和蛋白胨含量分别改为5g/L和5g/L、25g/L和25g/L、5g/L和25g/L、25g/L和5g/L，以10g/L淀粉和10g/L蛋白胨为对照组；第十组进行培养基初始pH值优化，分别调节培养基初始pH值为4、5、6和8，以初始培养基pH为7.0作为对照组；第十一组进行接种量优化，分别将接种量改为0.5%、2%和8%，以4%接种量为对照组。