基于ITS序列分析铁皮石斛试管苗的亲缘关系

基于ITS序列分析铁皮石斛试管苗的亲缘关系顾慧芬1，庄意丽1，梅其春2（1.上海市中药研究所上海201203；2.复旦大学生命科学学院上海200433）摘要：采用分子系统学方法分析铁皮石斛试管苗及其近缘种的遗传多样性，为准确进行基源鉴定、阐明属内的种间关系及发现新的药用资源提供分子证据。采集三十多种石斛样品分离提取DNA，PCR扩增ITS区及5.8SrDNA完整序列并测序，用Mega3.1软件进行系统学分析。采用邻接法和最大简约法分析铁皮石斛试管苗亲缘关系，对三十多种石斛类植物的ITS区序列进行分析，两种方法得到的系统树基本一致。ITS序列在石斛种间存在极其显著的差异，铁皮石斛与其它各种石斛均有各自特异性的序列位点，树状图显示铁皮石斛试管苗与野生铁皮石斛源于同一物种，而石斛属其它种与这两种遗传关系较远。关键词：铁皮石斛试管苗；ITS序列；系统发育；亲缘关系所属专业：生化与生物技术药物ThePhylogeneticRelationshipsofTissueCultureSeedlingsofDendrobiumcandidumBasedonEvidencesfromITSSequencesGUHui-fen1，ZHUANGYi-1i1，MEIQi-chun2(1．ShanghaiInstituteofChineseMateriaMedica，Shanghai201203，China；2．SchoolofLifeSciences，FudanUniversity，Shanghai200433，China)Abstract：MolecularsystematictechniqueswereappliedtorevealthegeneticdiversityofmedicinalplantofDendrobiumcandidumandtheirrelatedspeciesinDendrobium.Theinternaltranscribedspacer(ITS)aswellas5.8SrDNAsequencesofmorethan30samplesofDendrobiumwereamplifiedusingPCRmethodandsequenced．Mega3.1wasusedtoanalyzethegeneticdiversitywithingenus.PhylogeneticrelationshipsamongspeciesinDendrobiumandtissuecultureseedlingsofDendrobiumcandidumasoutgroupwereestimatedbymaximumparsimonyandneighbor—joiningmethodswithMega3.1software，andsimilarITStreeswereobtainedwiththetwomethods.TheresultsofphylogeneticanalysisalsoindicatethatthetissuecultureseedlingsofDendrobiumcandidumhasaclosedrelationshipwithDendrobiumcandidum,whilebothDendrobiumcandidumandtissuecultureseedlingsofDendrobiumcandidumarethemostdistanttotheotherspeciesofDendrobium.Keywords：tissuecultureseedlingsofDendrobiumcandidum；ITSsequence；phylogeny；relationship铁皮石斛（DendrobiumcandidumWall.exLindl），为兰科（Orchidaceae）石斛属（DendrobiumSw.）多年附生草本，是我国传统名贵中药之一，为石斛之上品，具有润喉消毒、生津益胃、清热养阴等功效。药理研究显示铁皮石斛是一类很有价值的中药类免疫增强剂[1]-[2]，临床上也广泛的用于肿瘤病人手术及化疗后的辅助治疗。随着铁皮石斛研究的不断深入，市场对铁皮石斛的需求也不断增大。近年来通过无性繁殖即组织培养培植试管苗，获得了成功，实现了资源的可持续开发和利用。药用植物在采用组织培养等进行繁殖和人们在栽培的过程中，由于改变了其生态环境和人类的干扰，其遗传特性等方面是否会发生变化，也是人们关注的问题之一。随着分子生物技术的迅速发展，DNA分子标记技术在中药鉴定方面的应用已取得了许多进展[3]-[10]。由于rDNA的ITS区域具有较多的碱基变异信息，在长度上具有较好的保守性，因此近10年来被广泛地用于植物属间与种间系统关系的研究。ITS之所以成为被子植物系统与进化研究中的重要分子标记，主要基于以下两个方面原因：第一，作为18S226SrDNA的一个组成部分，ITS在核基因组中是高度重复的，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进化，这就为对PCR扩增产物直接测序奠定了理论基础；第二，DNA测序工作的难易程度及成本与DNA片段长度有密切关系，裸子植物ITS区的长度变化范围很大，而被子植物的ITS区长度则比较稳定，包括5.8SrDNA在内，总长度只有600～700bp，为测序带来了很大方便。本研究利用rDNA的ITS对石斛属植物的序列进行比较分析，旨在探讨其种间的遗传变异以及它们之间的亲缘关系，为铁皮石斛试管苗系统学研究提供资料。1材料和方法1.1样品收集实验材料的名称和来源具体见表1，铁皮石斛试管苗由中药研究所提供，其中野生铁皮石斛分别采自云南、广西等产区,金钗石斛来自于南京，石斛其它种类均采自于云南。表1、材料名称和来源Tab．1Originandn01Tte0fplantmaterials编号材料名称编号材料名称编号材料名称1D.devonianum齿瓣石斛Ⅰ2D.devonianum齿瓣石斛Ⅱ3D.strongylanthum梳唇石斛4D.crystallinum冒晶石斛Ⅰ5D.crystallinum冒晶石斛Ⅱ6D.aduncum钩状石斛7D.moniliforme细茎石斛Ⅰ8D.primulinum报春石斛9D.henryi疏花石斛10D.moniliforme细茎石斛Ⅱ11D.falconeri串珠石斛12D.sp好竹签13D.aphyllum兜唇石斛14D.chrysanthum束花石斛15D.crepidatum玫瑰石斛16D.hercoglossum重唇石斛17D.monticola藏南石斛18D.linawianum短唇石斛19D.bicolor二色金石斛20D.gratiosissimum杯鞘石斛21D.pendulum肿节石斛22D.chrysotoxum鼓槌石斛23D.trigonopus翅梗石斛24D.fimbriatum马鞭石斛25D.thyrsiflorum球花石斛26D.candidum铁皮石斛E30D.candidum铁皮石斛A31D.candidum铁皮石斛A（干品）32D.nobile金钗石斛Ⅰ33D..nobile金钗石斛Ⅱ34D.nobile金钗石斛Ⅲ35D.nobile金钗石斛Ⅳ36D.candidum铁皮石斛.C38D.candidum铁皮石斛F39D.candidum铁皮石斛D40D.candidum铁皮石斛B注：铁皮石斛A为组培试管苗；B、C、D、E、F分别采自云南、江西、福建、广东、广西1.2方法1.2.1DNA抽提选择表1样品适宜叶片和茎0.1g左右，剪碎后液氮研磨，加入800μlCTAB-free[100mmol/LTris/HCl（pH=7-8），5mmol/LEDTA,0.35mmol/L山梨醇，1%PVP]，12000r离心6min。弃上清，加入600μl左右65℃预热的2×CTAB抽提缓冲液[100mmol/LTris/HCl（pH=8），1.4mol/LNaCl，2%PVP，20mmol/LEDTA，2%CTAB（w/v），0.34%巯基乙醇（v/v）]，65℃保温60min。取出后冷却到室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），抽提，离心10min。取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），再次抽提，离心。取上清液，加入1/10体积的NaAc，2/3体积的异丙醇（-20℃预冷），混匀之后放入-20℃保存30min左右，12000r离心10min。弃上清，70%乙醇洗涤2次，37℃烘干乙醇，加入50μlTE溶解。4℃保存备用。1.2.2ITS片段的PCR扩增与序列测定引物的设计与合成设计铁皮石斛ITS序列一对引物，由上海生物工程有限公司合成。引物：ITS1（5’-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGT-3’）ITS2（5’-GTAAGTTTCTTCTCCTCCGCT-3’）ITS区片段的PCR扩增PCR反应在20µl的体系，每个反应体系中包括10ng基因组DNA，2mMMgCl2，0.2mMdNTPs，1U的TaqDNA聚合酶，10mmol/LThis-HCl，以及各0.5μmol/L的正向和反向引物。PCR反应在2700PCRAmplfier热循环仪中进行。PCR反应参数：94℃预变性3min，94℃变性45sec，58℃退火45sec，72℃延伸60sec，10个循环，94℃变性45sec，54℃退火45sec，72℃延伸60sec，30个循环。72℃延伸10min，反应结束后，产物置4℃保存。扩增得到核糖体DNA的ITS片段(包括ITS1，5.8SrDNA和ITS2)。PCR产物的序列测定测序反应在MJResearch公司的PTC-200PCR仪上进行，反应程序为：96℃变性10sec，50℃退火10sec，6O℃延伸4min，25个循环，反应总体积为1Oμl。用Bigdye循环测序试剂盒在ABI公司(美国应用生物系统公司)ABI3730全自动测序仪上进行正、反链双向测序。1.2.3序列分析DNA序列的排序用CLUSTALX软件完成，排序后的序列使用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）3.1分子进化遗传分析软件，Kimura-2参数遗传距离（Kimura-2parametergeneticdistance），采用邻接法和最大简约法构建NJ系统树和MP系统树，系统树各分支的置信度用自展检验法（bootstraptest）检验，共进行2000次循环，以评价各分支的系统学意义与可靠性。2结果与分析选择了ITS(内转录间隔区)的片段，采用热启动PCR的方法对铁皮石斛试管苗、6种不同产地野生铁皮石斛及二十多个石斛类品种进行了扩增。获得了由ITS序列绘制的NJ系统树和MP系统树。图1：根据ITS区序列数据用Kimura2-参数距离计算出的NJ系统树Fig．1Theneighbor-joiningtreeusingKimura’stwo-parameterdistancesbasedonITSsequences邻接树的拓扑结构显示（图1），铁皮石斛的序列聚集在一起，形成一个分化支（自展值为99%）。其中两个亚分支由野生铁皮石斛和铁皮石斛试管苗组成的支持率相对较高（62％，71％），表明铁皮石斛试管苗与野生铁皮石斛源于同一物种。而石斛属其它种与这两种遗传关系相对较远。因此对于这种种内保守、种间分化活跃且差异明显的DNA序列作为石斛属植物的分子标记是可行的。图2：根据ITS区序列数据用Kimura2-参数距离计算出的MP系统树Fig．2ThesinglemostparsimonioustreeusingKimura’stwo-parameterdistancesbasedonITSsequences最大简约树（图2）与邻接树相似，铁皮石斛的序列聚集在一起，形成一个分化支，但自展值相对较低为77%。拓扑结构显示，与邻接树一致，两个亚分支由野生铁皮石斛和组培铁皮石斛组