基于PCR的cDNA基因克隆技术研究进展

1基于PCR的cDNA基因克隆技术研究进展蔡欣1陈宏2,3汪虹英4(1.西北农林科技大学生命科学院，陕西省农业分子生物学重点实验室,杨凌712100;2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室,杨凌712100;3.徐州师范大学生物技术研究所,徐州221116;4.甘肃省漳县一中,甘肃漳县748300)摘要RT-PCR、single-sided(anchored)PCR、RACE以及stepoutRACE、DDRT-PCR、cDNARDA、SSH等都是建立在PCR基础之上的cDNA分子克隆技术，本文介绍各种技术的优缺点、应用以及与同类技术进行比较，这些技术现在已经成功应用于大量EST的分离、cDNA文库的构建、编码产物未知的差别表达基因的分离以及全长cDNA基因序列的克隆等方面。关键词cDNA基因克隆;PCR;特点；应用中图分类号:Q7ResearchProgressonPCR-basedTechniquesofcDNAGeneCloningCAIXin1CHENHong2,3WANGHong-ying4(1CollegeofLifeScience,NorthwestSci-techUniversityofAgricultureandForestry,ShaanxiKeyLaboratoryofAgricultureMolecularBiology,Yangling,Shaanxi712100China;2CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestSci-techUniversityofAgricultureandForestry,ShaanxiKeyLaboratoryofAgricultureMolecularBiology,Yangling,Shaanxi712100,China;3.InstituteofBiotechnology,XuzhouNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221116,China;4theFirstMiddleSchoolofZhangxianCounty,Zhangxian,Gansu748300,China)Abstract:RT-PCR,single-sided(anchored)PCR,RACE,stepoutRACE,DDRT-PCR,cDNARDAandSSHareallthetechniquesofcDNAcloningbasedonPCR.Theadvantagesanddisadvantagesofeachtechniqueweredicussedandcomparedwiththoseoftheircounterparts.ThesetechniquesarenowsuccessfullyusedinthefieldsofisolationofnumerousESTs,constructionofcDNAlibraries,obtainingofdifferentiallyexpressednewgenesandcloningofcDNAinfulllength.Keywords:cDNAgenecloning;PCR;characteristics;applicationsKaryMullis等在1983年发明的PCR技术[1]现在已经成为分子生物学及其相关领域的经典实验方法，目前由PCR技术衍生出许多重要的相关技术，它们在基因克隆、基因测序、基因检测、基因改造以及突变分析等分子生物学以及其它生命科学研究中具有重要的应用价值；目前有许多cDNA基因克隆方法主要是建立于PCR及其衍生技术之上的，原有技术被不断改进、新的技术被不断发明，它们在cDNA文库的构建、EST的分离、cDNA基因克隆、新基因的分离、基因表达的检测分析等研究领域发挥着重要的作用。1RT-PCR当我们期望从某一序列已知的mRNA克隆cDNA时，就可以利用RT-PCR(reversetranscriptionPCR)，即逆转录PCR方法,其原理是由mRNA通过逆转录反应产生的DNA链作为模板进行常规PCR扩增[2]。由于RT-PCR的放大作用和很高的敏感性，所以具有显著的优点：首先，该方法不需要纯化mRNA，总RNA就可以作为合成单链cDNA的模板，因而避免了纯化过程中mRNA的降解以及丢失；其次，该方法中单链cDNA合成后其3′末端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核苷酸，所以可以获得相当于mRNA5′末端的比较完整的序列，其中也包含着未知序列的cDNA群体[3]。RT-PCR还可以用于检测mRNA分子，PCR测序以及探针的制备等。[项目基金]国家863项目(2001AA243052，2003AA243051),国家自然科学基金（30471238），中华农业科教基金（99-03-A-5）资助[作者简介]:蔡欣(1973—)，男，甘肃漳县人,博士生，专业：生物化学与分子生物学[通讯作者]:陈宏(1955—)，男，陕西长安人,博士生导师，教授，研究方向：生物技术与动物分子遗传学22single-sided(anchored)PCR利用RT-PCR方法进行cDNA基因克隆时，首先需要有mRNA或cDNA的全长序列资料，以便根据其设计合适的引物，然后才能进行目的mRNA或cDNA全长序列的扩增；而在实际工作中，我们往往获得到的是mRNA或cDNA的部分序列，如欲获取其全长序列信息，可以选择采用single-sided(anchored)PCR,即单侧(锚式)PCR。基本原理是根据已知的mRNA或cDNA部分序列设计基因特异性引物(gene-specificprimer,GSP),同时利用寡聚胸腺嘧啶核苷酸oligo(dT)作锚定引物，进行已知序列上游序列或者下游序列的PCR扩增[4]。本方法适合于根据已知cDNA部分序列来扩增cDNA全长序列，在进行PCR扩增时除了设计的基因特异性引物(GSP)之外，还需要一条锚定引物oligo(dT)20，如果与待扩增的cDNA相应的mRNA不具有Poly(A)尾，此方法就不适用。理论上讲，锚式PCR只需要一条基因特异性引物(GSP)，但是在实际工作中为了提高扩增的特异性，常常需要设计第二条特异性引物进行第二轮PCR扩增，第二条特异性引物可以与第一条引物相邻或者部分重叠。3RACERACE(rapidamplificationofcDNAends)，即cDNA末端的快速扩增，也是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列的PCR技术,其基本原理是：首先根据已知的cDNA部分序列设计GSP,以mRNA为模板逆转录合成单链cDNA，再通过常规PCR扩增出从已知核苷酸序列内某一特定位点到3′末端或者5′末端之间的未知核苷酸序列，所以又可以分为3′RACE和5′RACE[5]。3′RACE可以利用mRNA的Poly(A)尾设计锚定引物；但是进行5′RACE时，先要将合成的第一条cDNA链3′末端加上同聚物尾，再根据其设计锚定引物。4stepoutRACE常规的RACE存在着步骤繁多、费时和特异性比较低等缺点。后来Matz[6]及其合作者在RACE方法的基础上，根据PCR抑制作用(PCR-suppressioneffect,PS-effect)[7]和cDNA合成过程中存在的模板转辙作用(‘template-switching’effect,TS-effect)[8],同时采用了touchdownPCR技术[9]，将5′RACE和3′RACE方法进行了改进，显著提高了灵敏度和扩增的效率，降低了扩增背景，将这种cDNA末端的快速扩增技术称为stepoutRACE，翻译为“越轨”RACE。此技术利用鼠白血病病毒莫勒尼株(Moloneymurineleukemiavirus，MMLV)逆转录酶在cDNA新链的合成到达mRNA模板的5′末端时能够将若干个非模板的核苷酸(主要为dC)聚合到新合成cDNA链的3′末端的特性，实现模板转辙作用；PCR扩增过程中过加入一对大小不同的SO-PCR(越轨PCR)引物，小引物与大引物的5′端部分序列重叠，而大引物的3′端序列与TS-oligo(模板转辙-寡聚核苷酸)的大部分序列重叠，则经过一轮PCR反应形成的DNA双链分子的各条单链都形成“锅柄”样(panhandle-like)结构而不能进行后续PCR扩增，进而实现PCR抑制作用。他们利用此项技术对人胎盘中的13种mRNA进行了检测，其中丰度最低的相应于干扰素α受体和白细胞介素10的cDNA5′和3′末端都被成功扩增。虽然stepoutRACE技术与同类的RACE技术[5]相比较具有操作简便、高效和灵敏的特点，但是它还是解决不了由于RT反应造成的RACE技术普遍存在的问题，如mRNA很长或者形成稳定的二级结构而致使合成的cDNA完整性降低等。邱为民等人[10]根据已知的EST序列设计引物，通过stepoutRACE技术成功地克隆出了三个人类精子发生相关基因的全长cDNA序列。5DD-PCR或DDRT-PCR生物的发育、细胞的分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力的反应以及细胞的凋亡和个体的衰老等所有的生命过程都可以归结于基因的差别表达，因此比较不同细胞或者不同基因型在基因表达上的差异，即mRNA种类的差别为我们深入了解生命过程的本质打开了方便之门[11]。虽然应用传统的mRNA差减杂交和扣除杂交技术也分离到了一些重要的基因,但是这两种方法存在费时费事、重复性差、难以适应成批样品的检测研究等。在PCR技术发展的基础上，1992年美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家Liang和Pardee[12]发明了DD-PCR(differentialdisplaymRNAbyPCR)或DDRT-PCR(differentialdisplayreversetranscriptionPCR)技术，即mRNA差别显示PCR或者差别显示反转录PCR技术，在一定程度上克服了差减杂交和扣除杂交技术的不足之处。虽然该技术克服了差减杂交和扣除杂交技术的缺点，但是仍然存在着工作量大、成本高、假阳性率高、重复性差以及分离的cDNA片段比较短小等不足之处。36cDNARDA为了克服mRNA差别显示技术在实际应用中存在的不足之处，1994年,Hubank和Schatz[13]在Lisitsyn[14]等人发明的基因组代表性差示分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)技术基础上，发展了一种称为cDNA代表性差示分析技术,简称cDNARDA。此方法保留了差减杂交和DD-PCR的精华，同时充分发挥了PCR反应以指数形式扩增双链模板、以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法，特异地扩增目的基因片段,与DD-PCR相比具有假阳性低、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。Hubank等人通过此项技术成功地从小鼠成纤维细胞系TXH8中分离到了两个重组激活基因(recombinationactivationgene)RAG-1和RAG-2的编码序列，同时还从一个经咖啡因诱导的小鼠前B细胞系1-8中克隆到了胰岛素样生长因子1B(insulinlikegrowthfactor,IGF-1B)基因和与天然杀伤细胞抗原(naturalkillercellantigen)基因NKR-P1类似的编码序列。但是令人遗憾的是，cDNARDA技术美中不足，也存在着操作复杂、实验周期长以及费用高等缺点，为此刁丰秋[15]等人对此技术作了若干重要的改进，使实验程序大大简化。改进后的cDNARDA技术可以用于高等动植物与发育相关以及其它差别表达的未知基因编码序列的克隆。7SSHSSH(suppressionsubstractivehybridization),即抑制性消减杂交技术，是由Diatchenko[16]等人在PCR抑制作用[7]的基础上所创建的，是