叶绿素测定方法

实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法)根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca+9.27Cb………………(1)A645=16.75Ca+45.6Cb………………(2)式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。解联立方程(1)、(2)可得以下方程：Ca=0.0127A663-0.00269A645…………(3)Cb=0.0229A645-0.00468A663…………(4)如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645…………(5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663…………(6)叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7)叶绿素总量也可根据下式求导A652=34.5×CT由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5………(8)因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。一、仪器、药品与材料（一）实验材料不同生境的新鲜植物叶片。（二）仪器与用品分光光度计，天平（感量0.01g），研钵，漏斗，量筒，滤纸等。（三）试剂１．丙酮。2．80％丙酮：取80mL纯丙酮加入20mL蒸馏水混匀即得。3．石英砂。4．无水CaCO3。二、实验步骤1．叶绿体色素溶液提取：选取不同生境下生长植物的成熟叶片按照实验七-I中方法用80%丙酮进行提取。2．测定吸光度值：以80%丙酮作为参比溶液，分别在652nm、663nm和645nm处测定叶绿体色素提取液（浓度大时需稀释）的光吸收值。3．计算：把测得的光吸收值代入上述5、6、7和8等公式计算出叶绿素a、b和叶绿素总量。在计算时需要考虑稀释因子。