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1备课教案学年学期：2011-2012秋季学期课程名称：基因克隆主讲教师：李海英授课对象：2009级生命科学学院本科黑龙江大学2第1教学周/第3.4.5节（第1次课）教学基本内容备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握基因克隆、重组DNA等相关概念，同时介绍基因工程的发展简史和基因工程的巨大意义，引导学生对科学的严谨、谦虚态度。教具：多媒体课件教学重点：DNA嵌合体概念课时安排：3学时教学难点：基因克隆与基因表达的技术路线的区别教学内容：第一章绪论一、基因工程的概念1.基因工程（geneticengineering）、遗传工程、重组体DNA技术2.嵌合DNA、DNA嵌合体（DNAchimera)3.分子克隆（molecularcloning)、基因克隆(genecloning)、重组DNA(recombinantDNA)4.基因工程的操作步骤（1）基因克隆的操作步骤（2）基因表达的操作步骤二、基因工程发展简史三、基因工程的巨大意义1.利用微生物制药（1）利用微生物生产胰岛素（2）重组微生物生产生长激素（3）重组微生物生产干扰素2.克隆技术（clonetechnology）（1）克隆的概念（2）器官移植1、启发式教学内容：启发学生的学习科学和实验操作的态度。2、互动教学内容：课堂讨论克隆的伦理道德问题。3（3）干细胞研究及人类伦理观念3.基因工程育种（1）基因改造的农作物（2）转基因动物四、基因工程的安全性问题复习题1、基因克隆与基因表达技术路线的区别。2、收集整理有关转基因植物、转基因动物的报道和照片资料。3、启发式教学内容通过对转基因植物和转基因动物的介绍，激发学生的学习兴趣。4第2教学周/第3.4.5节（第2次课）教学基本内容备注教学目的：本节主要讲述有关“限制性核酸内切酶”的相关知识，通过对大肠杆菌限制-修饰现象的讲解，引导学生探究宿主控制性限制的生物学机理；掌握各类限制性核酸内切酶的生物学功能和命名原则。教具：多媒体课件教学重点：Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点和限制性核酸内切酶生物学功能的英文表述。课时安排：3学时教学难点：限制-修饰现象的理解教学内容：第二章基因工程的工具酶第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶的发现1.发现过程2.相关概念（1）限制(restriction)（2）修饰(modification)（3）宿主控制性限制(host—controlledrestriction)3.限制性核酸内切酶的生物学功能Restriction-modificationsystemsoccurinmanybacterialspecies,andconstituteadefensemechanismagainsttheintroductionofforeignDNAintothecell.Theyconsistoftwocomponents;thefirstisarestrictionendonuclease,whichrecognizesashort,symmetricalDNAsequence,andcuts(hydrolyzes)theDNAbackboneineachstrandataspecificsitewithinthatsequence.ForeignDNAwillhencebedegradedto1、课前提问（1）DNA嵌合体概念（2）基因克隆的操作步骤（3）基因表达的操作步骤2、通过对大肠杆菌限制-修饰现象的描述，引导学生探究其中的原因。3、利用对Smith和Nathans获得1978年诺贝尔生物医学奖的介绍，激励学生探索生命的奥秘。5relativelyshortfragments.Thesecondcomponentofthesystemisamethylase,whichaddsamethylgrouptoaCorAbasewithinthesamerecognitionsequencesinthecellularDNA.ThismodificationrendersthehostDNAresistanttodegradationbytheendonuclease.二、限制性核酸内切酶的分类1.Ⅰ型限制性核酸内切酶2.Ⅱ型限制性核酸内切酶（1）一般性质（2）Ⅱ型酶的识别序列与切割作用A.识别序列B.平末端（blunt/flushend/termini)C.粘性末端（sticky/cohesiveend/termini)（3）Ⅱ型限制性内切酶的特点（4）酶切位点的计算3.III型限制性内切酶三、限制性核酸内切酶的命名复习题一、填空题1、完全的回文序列具有两个基本的特点，分别是（）和（）。2、由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是（）。3、第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是（）。4、核酸内切酶命名原则是，第一个大写字母取自（），第二、三两个字母取自（），第四个字母则用（）表示。4、注意区别粘性末端和平末端、同裂酶和同尾酶两对概念。6二、简答题下面几种序列中，那些最有可能是Ⅱ类酶的识别序列，为什么？GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA7第3教学周/第3.4.5节（第3次课）教学基本内容备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握天然DNA的制备、纯化和浓缩以及限制性内切酶反应系统的建立，本章重点内容是影响限制性核酸内切酶活性的各种因素，并要求学生掌握限制性核酸内切酶的星活性、限制性图谱等概念。教具：多媒体课件、教具教学重点：影响核酸内切限制酶活性的因素课时安排：3学时教学难点：DNA分子的限制性图谱的构建教学内容：第二章基因工程的工具酶第二节DNA分子片段化一、天然DNA的制备1.天然DNA的来源2.天然DNA的提取二、DNA的纯化三、DNA的浓缩四、限制性核酸内切酶反应系统1.限制性核酸内切酶反应缓冲液2.单酶切法3.双酶切法4.部分酶切5.DNA分子的限制性图谱五、影响核酸内切限制酶活性的因素1.性活性2.DNA样品的纯度3.DNA甲基化的程度4.DNA的分子结构1、课前提问Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点。2、互动教学内容：让学生总结DNA的制备、DNA的纯化和DNA的浓缩三个概念的区别，引导学生利用比较的方法学习知识。85.侧翼序列长度6.酶切反应缓冲液7.酶切反应温度和时间复习题1.什么是限制性内切酶的星活性？受哪些因素影响？2.分别用EcoRⅠ、HpaⅡ、EcoRⅠ+HpaⅡ酶切一个DNA片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型（如下图），请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明EcoRⅠ和HpaⅡ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。并请写出分析的过程9第4教学周/第3.4.5节（第4次课）教学基本内容备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握DNA聚合酶概念、分类、各种DNA聚合酶的性质和用途，以及对一些专业名词的正确理解，如间断、缺刻等。教具：多媒体课件教学重点：各种DNA聚合酶的性质和用途课时安排：3学时教学难点：用切口平移（缺口转移）方法标记DNA以及一些专业名词的正确理解。教学内容：第二章基因工程的工具酶第三节DNA聚合酶一、DNA聚合酶概述1.DNA聚合酶（polymerase）的概念2.DNA聚合酶的分类（1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型”；（2）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性；（3）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板。二、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）1.性质2.用途：用切口平移（缺口转移）方法标记DNA三、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）1.性质2.用途四、T4噬菌体DNA聚合酶1.性质2.用途1、课前提问：（1）影响限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？（2）双酶切时有哪些是需要主义的问题？2、启发式教学内容：（1）启发学生比较间断（discontinuity）和缺刻（nick）两个概念。（2）引导学生比较三类DNA聚合酶在作用方式上的差别。3、课堂活动内容：大肠杆菌DNA聚合酶I同时具有5ˊ→3ˊ方向的聚合酶活性和3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性，这意味着即使5ˊ→3ˊ方向的聚合酶活性新合成了DNA分子也会立即被其同时具10五、T7噬菌体DNA聚合酶1.性质2.主要用途六、TaqDNA聚合酶1.性质2.用途：用于PCR反应，使得PCR技术得以推广。七、逆转录酶（reversetranscriptase）——（依赖于RNA的DNA聚合酶）1.性质2.用途复习题一、填空1.T4DNA聚合酶与Klenow酶一样，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶两种活性，但它的3’→5’外切酶活性比Klenow酶强（）倍，T4DNA聚合酶作用于（）链的活性要强于（）链。2.反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有（）的作用，可以将DNA-RNA杂种双链中的（）水解掉。二、判断题1.反转录酶能够以单链RNA或DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的DNA链。2.以RNA为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的cDNA，双链DNA是由自身引物引导合成。三、问答题如何利用T4NA聚合酶制备3’隐含末端或双链平末端？有的3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性所降解。真实情况是这样的吗？4、课堂互动内容自1983年PCR技术问世年到发明人Dr.KaryMullis1993年获得诺贝尔化学奖经历了10年的时间，那么一项技术得到广泛应用、认同需要什么？11第5教学周/第3.4.5节（第5次课）教学基本内容备注教学目的：通过对本次课的学习，重点使学生掌握锚定PCR、不对称PCR和反向PCR三种特殊的聚合酶链式反应以及一种分子标记技术——RAPD。教具：多媒体课件教学重点：三种特殊的聚合酶链式反应的原理课时安排：3学时教学难点：RAPD技术的基本原理教学内容：第二章基因工程的工具酶第四节聚合酶链式反应及应用一、锚定PCR1.已知序列3’端区域的扩增2.已知序列5’端区域的扩增二、不对称PCR三、反向PCR第五节RAPD技术一、多态性（polymorphism)1.多态性/差异性的概念2.多态性的种类3.多态性产生的过程4.多态性的相关技术二、RAPD基本原理三、技术问题1.引物2.Mg2+浓度要求四、RAPD技术的应用1、课前提问：（1）缺刻（nick）和间断（discontinuity）两个概念。（2）比较各种DNA聚合酶的活性用什么不同之处。互动内容：提问常规PCR的原理，引导学生思考如果目的片段两侧的序列未知，而是只知道目的片段中间的一部分的序列信息，用什么方法可以获得目的片段？121.遗传指纹作图2.检测遗传多样性与稳定性复习题1.生么情况下可以考虑使用不对称PCR?2.反向PCR的原理？3.RACE技术的原理？13第6教学周/第3.4.5节（第6次课）教学基本内容备注教学目的：通过对本次课的学习，重点使学生掌握DNA连接酶相关知识，如DNA连接酶的特性、粘性末端连接技术、连接反应的建立等。教具：多媒体课件教学重点：DNA连接酶的功能和粘性末端连接技术课时安排：3学时教学难点：粘性末端连接技术教学内容：第二章基因工程的工具酶第六节DNA连接酶（ligase）一、连接酶反应1.间断修复功能2.连接功能二、常用的DNA连接酶1.E.coliDNA连接酶2.T4DNA连接酶T4DNAligaserepairsbreaksinadsDNAbackboneandcancovalentlyrejoinannealedcohesiveendsinthereverseofarestrictionenzymereaction,tocreatenewDNAmolecules.T4ligasecanevenligateonebluntendtoanother,albeitwithratherlowerefficiency.3.RNA连接酶三、粘性末端连接技术1、衔接体(linker)技术2、结合体(adaptor)技术3、同聚体(homopolymer)加尾技术课前提问：1、反