基因工程实验指导书

实验项目重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测实验项目类型：综合性所属课程名称：《基因工程》实验计划学时：8学时一、实验目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。二、实验原理1、提取质粒原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。2、质粒DNA的酶切鉴定原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。三、实验材料与仪器1、仪器超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。2、试剂pGEM-T-AT8载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。EcoRI，XbaI，SacI，XhoI，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲四、操作步骤1、实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200L5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121C20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），70%乙醇（-20C保存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；10mg/mLRNaseA（RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C30min）。2、操作步骤1）制备质粒DNA（1）在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。（2）从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pGEM-T-AT8载体菌种（挑白色克隆！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。（4）在沉淀中加入预冷的100l溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）（5）加入200l溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6）加入150l预冷的溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（7）15000rpm离心5min，小心吸取400l上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800l95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8）15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9）再加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（10）离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。（11）加入30l无菌蒸馏水或TE缓冲液；3管pET-his质粒中每管加入10l蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1lRNaesA。用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12）电泳检测2）酶切（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：pGEM-T-AT8（质粒DNA）6μL10×酶切缓冲液（用EcoRI的缓冲液）2μLddwater30μLEcoRI1μLBamHI1μL总体积40μL（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1μL限制性内切酶。（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3h（一般是37℃）。（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。（6）酶切后的质粒可以回收备用。（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。五、实验报告六、思考题泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？实验项目ß-半乳糖苷酶基因（lacZ）的定点突变实验项目类型：基础性所属课程名称：《基因工程》实验计划学时：6学时一、实验目的1.学习并掌握利用PCR进行基因缺失和插入定点突变的基本原理和实验方法。2.复习碱法小量制备质粒DNA的原理和方法。二、PCR介导的基因定点突变的基本原理载体pSV-β-半乳糖甘酶大小是6820bp（图实验1-1），其上带有完整的lacZ基因，其中lacZ基EDTA因的起始位点是710bp，终止位点（TAA）是3755bp.通过改变5‘端引物或（和）3’引物中的核苷酸序列或数目，可利用多聚酶链式反应（PCR）进行基因的定点突变。本实验的定点突变均设计在5‘端引物上，而3’端引物上（4279-4302bp）无突变。其中一条突变的5‘端引物上插入了TCC3个核苷酸，这条引物位于3880-3901bp,PCR扩增后得到的，插入突变DNA片段长度是425bp。另一条突变的5’端引物上缺失了TAC3个核苷酸，这条引物位于3874-3901bp，PCR扩增后得到的缺失突变DNA片段长度也是425bp.pSV-β-半乳糖甘酶质粒插入突变的5′端引物（下划线是插入的核苷酸）：P5c：5′AGCCTACTCCTTCCCGTTTTTCCCG3′缺失突变的5′端引物（虚线是删除的3个核苷酸）：P5q：5′CATGGGAGCC---TTCCCGTTTTTCCCG3′3′端引物：P3：5’GTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGC3’突变的PCR扩增产物的DNA序列图PCR介导的插入突变和缺失突变示意图3851TTCTTTTTCTTTTACTTTTTTATCATGGGAGCCTACTTCCCGTTTTTCCC3901GATTTGGCTACATGACATCAACCATATCAGCAAAAGTGATACGGGTATTA3951TTTTTGCCGCTATTTCTCTGTTCTCGCTATTATTCCAACCGCTGTTTGGT4001CTGCTTTCTGACAAACTCGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTAC4051AAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACT4101GCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCT4151GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTGGCACTGGCCGTCGT4201TTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCC4251TTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGC4301ACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTlacY3809-40115′引物5′引物3′引物3′引物TCC三、实验材料与仪器1、质粒：pSV-ß-半乳糖苷酶；菌株：大肠杆菌JM109菌株。2、溶液或试剂：LB液体培养基，溶液I，0.4NNaOH，2%SDS，溶液III，无水乙醇，70%乙醇，氯仿，Tris-HCl饱和酚，TE缓冲液，TAE缓冲液。琼脂糖等。3、仪器或其他用具：恒温振荡培养箱，恒温培养箱，制冰机，台式离心机，超净工作台，PCR仪，电泳系统，凝胶成像系统，微量移液器，吸头等。四、操作步骤1、菌体的培养挑取含有pSV-ß-半乳糖苷酶质粒的大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃振荡培养过夜。2、质粒DNA的提取⑴从平皿上挑取单克隆接入2ml含Amp的LB（100μg/ml）培养液中37℃过夜振荡培养。⑵转移约1.2ml过夜培养物到1.5ml离心管中，10，000rpm离心1min，弃上清后，再离心5s，吸去剩余上清。⑶每个离心管中加入预冷的溶液Ⅰ100μL，在混合器上振荡使菌体充分悬浮、分散、混匀。⑷每管加200μL新配制的溶液Ⅱ，缓慢倒转几次混匀，冰上放置5min，使细胞膜完全裂解。⑸每管各加150μL预冷的溶液Ⅲ，倒转几次混匀混匀，冰上放置10min,此时酸碱中和，质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不溶性复合物，同时钾盐使游离的SDS沉淀。⑹12，000rpm离心10min，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白，取上清。⑺上清液用等体积的Tris-HCl饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次。⑻上清液用等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次。⑼上清液用2倍体积的无水乙醇沉淀30min以上。⑽12，000rpm离心10min⑾去上清，用1ml70%乙醇洗涤沉淀一次，离心去上清后空气晾干。⑿每管加20μL含RNase（20μg/ml）的TE缓冲液溶解后，37℃消化30min以水解RNA。⒀取2ul电泳检测提取的量。其余的－20℃保存备用3、PCR扩增前的准备在两个PCR管中，分别加入以下组分：载体pSV-β-半乳糖甘酶（2.5ng/μL）1μL10×PCR反应液2.5μLMgCl2(25mmol/L)1.5μLdNTPs各（2.5mmol/L）2μL3‘末端引物（20μmol/L）1μL插入突变（或缺失突变）5‘端引物（20μmol/L）1μLTaqDNA聚合酶（1U/μL）1μL重蒸馏水15μL总体积25μL混匀后放入PCR循环仪。（添加一个试剂时，要使用新的无菌吸头，不要污染无菌贮液。）4、PCR循环按下列.PCR反应程序进行PCR循环94.℃3min94.℃30S55℃30S循环30次72℃30S72℃10min4℃保存。5、琼脂糖凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶制备：配制1.0%的琼脂糖凝胶。（2）上样：取5μL扩增产物加入1μL6×上样缓冲液，将6μL样品加入样品槽中。（3）电泳：恒压80Ⅴ，待染料迁移到前沿时停止电泳。（4）染色和电泳结果的观察：将凝胶在EB染色液染色15分钟后在紫外透射仪中观察染色的条带（若条带不清楚，可在EB染色液继续染色）。（其余的PCR扩增产物保存在-20℃，等待电泳结果，再做下一步实验，见实验二）五、实验报告分别绘出你所提取的质粒DNA的电泳图谱和PCR产物的电泳图谱。六、思考题1、你的PCR产物是否与预期的大小一致？为什么