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基因工程实验教学方案湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株Ⅰ质粒DNA的提取实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。实验原理1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。2．设计构建体外重组DNA分子构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图：仪器材料与试剂（一）仪器1．恒温摇床2．台式离心机3．漩涡混合仪（二）材料与试剂1．含pGEX-6P-1-mreB质粒的大肠杆菌DH5α2．含pGEX-6P-1质粒的大肠杆菌DH5α3．液体LB培养基4．100mg/mL氨苄青霉素Amp5．新捷质粒提取试剂盒实验步骤分为两组：一组提取质粒pGEX-6P-1-mreB，另一组提取质粒pGEX-6P-1。1）12000rmp离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul已加入RnaseA的BufferⅠ,充分悬浮细菌沉淀。2）加入250ulBufferⅡ,温和并充分地翻转离心管4-6次。3）加入350ulBufferⅢ,温和并充分地翻转离心管4-6次。4）13000rmp离心10分钟。5）将核酸纯化柱置于2ml离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。6）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ulBufferW2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000rmp离心1分钟。8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ulBufferTE,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。实验结果实验安排3个小时Ⅱ质粒DNA的转化实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌转化的方法与技术。实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。转化是指质粒DNA或以其为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细胞培养物涂在选择性培养基上。E.coliDH5α是一种用于质粒克隆的菌株。E.coliBL21是一种适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失。仪器材料与试剂（一）仪器1.超净工作台2.恒温摇床3.制冰机4.高压灭菌锅(二)材料与试剂1.大肠杆菌Bl21感受态细胞2.质粒DNA：pGEX-6P-1-mreB、pGEX-6P-1。3．固体LB培养基平板（含Amp120ug/ml）实验步骤分为两组：一组加入质粒pGEX-6P-1-mreB，另一组加入质粒pGEX-6P-1。1.取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰上放置30min。同时做一个对照管，仅加入100ul感受态细胞，不加质粒。2.将管放到42℃热击90s。3.冰浴2min。4.每管加400ulLB液体培养基，37℃培养1h(150r/min)5．将适当体积（200ul）的复苏细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养皿中，正置平皿30min。6.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。实验结果实验安排这整个大实验从质粒提取到转化需一天，第二天早晨观察结果。实验二外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达实验目的通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。实验原理将外源基因mreB克隆在含有Tac启动子的表达载体pGEX中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE进行检测，或做蛋白质印迹，用抗体识别表达蛋白。Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46bpDNA片段(包括Pribnow盒)和Lac操纵基因构成，Tac12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。仪器材料和试剂（一）仪器1.恒温摇床2.离心机3.超净工作台4.分光光度计（二）材料与试剂1.含pGEX-6P-1-mreB表达质粒的表达菌株E.coliBL21（DE3）plysS2.含pGEX-6P-1表达质粒的表达菌株E.coliBL21（DE3）plysS2.液体LB培养基3.100mg/mL氨苄青霉素Amp4.1mol/LIPTG实验步骤1.挑取一含有pGEX-6P-1-mreB表达质粒的单菌落到1.5mL含有100μg/mLAmp的液体LB培养基中，37度摇12小时。2.挑取一含有pGEX-6P-1表达质粒的单菌落到1.5mL含有100μg/mLAmp的液体LB培养基中，37度摇12小时。（这是不含目的基因仅含载体的对照）。3.将培养的菌液1mL接种于100mL含有100μg/mLAmp的液体LB培养基中，37度摇至A6000.6-0.8。4.向其中一瓶加入IPTG至终浓度0.4mmol/L,另一瓶不加（对照），转至28度诱导过夜。5.8000r/min离心收集菌体细胞沉淀，四种类型分别做好标记，-20度保存。注（四种类型分别为：pGEX-6P-1-mreB转化菌诱导，pGEX-6P-1-mreB转化菌未诱导，不含目的基因的pGEX-6P-1转化菌诱导，pGEX-6P-1转化菌未诱导。）ⅡSDS-PAGE检测表达蛋白实验目的通过本实验了解和掌握SDS-PAGE检测蛋白的基本原理和操作。实验原理SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆成亚单位，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异，所以SDS-PAGE消除了电荷效应，只有分子筛效应故蛋白质电泳迁移率完全取决于相对分子质量，迁移率与相对分子质量对数呈线性关系，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。仪器材料和试剂（一）仪器1.垂直板电泳槽及配套的玻璃板、封胶条、梳子2.恒压恒流电泳仪3.脱色摇床（二）材料与试剂PBS缓冲液2×LaemmLi样品缓冲液：100mmol/LTris-HCl（pH6.8），4%SDS，0.02%溴酚蓝，20%甘油，临用前加入100μL巯基乙醇到900μL上样液中。30%丙烯酰胺储液：丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺＝29：1(W/W)，置于棕色瓶中于4℃，隔几月需重配。分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-ClpH8.8浓缩胶缓冲液：1mol/LTris-ClpH6.810%SDS(W/V)(十二烷基硫酸钠)10％APS（W/V）（过硫酸胺）：取0.1gAPS定容至1mL，少量配制，隔周新配。电泳缓冲液：3.03gTris-base，14.4gGlycine，1gSDS，加蒸馏水至1L。固定液：40％乙醇，10％乙酸Bluesilver染色液：0.12％考马斯亮蓝G-250，10％（NH4）2SO4，10％H3PO4，20％甲醇。实验步骤1.配置12%分离胶双蒸水分离胶缓冲液30%胶贮液10%SDSTEMED10%AP6.7mL5mL8mL200uL10uL100uL（1）把玻璃板放入制胶架上，架好胶板，用琼脂封底。（2）按如下比例配好分离胶，混匀后立即加入到两玻璃板之间，到上口大于梳子插入的长度止，再加一层异丙醇，约30min等胶自然凝聚后倾斜倒出异丙醇，并用蒸馏水洗三次，倒干净蒸馏水。2.配置4%的浓缩胶双蒸水分离胶缓冲液30%胶贮液10%SDSTEMED10%AP6.1mL2.5mL1.3mL100uL10uL50uL混匀后立即加到分离胶上，在两玻璃板夹缝中水平插入1.5mm的梳子，用琼脂封住梳子两端。聚合后，把玻璃板放入电泳槽中，装好电泳缓冲液后小心拔出梳子。3．样品制备：样品与2×上样缓冲液1:1混匀（本实验Ⅰ的四种样品），并在100℃水浴中煮10min，取出待用。4.丄样、电泳：将样品和标准蛋白分别加到样品孔中开始电泳，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，直至溴酚蓝走至前沿为止。5．固定染色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶在固定液中固定30min,用蒸馏水洗三次，每次10min,再将凝胶在染色液中染色2h。实验结果实验安排第一天晚上挑菌落预培养第二天：诱导表达第三天：制胶，跑SDS-PAGE电泳检测。实验三Western杂交实验目的通过本实验了解Western杂交的方法和操作要点。实验原理Western杂交一般由：凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测手段如抗原抗体反应等三大实验部分组成。1.生物大分子凝胶电泳分离:Western杂交的第一步一般是将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,使待测蛋白在电泳中按分子相对质量大小在板状胶上排列。2.蛋白质样品的印迹和固定：第二步就是把凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理及容易检出，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。现用的最多的载体材料是PVDF聚偏氟乙烯膜，它们和生物大分子是非共价结合的。3.特异性谱带的检出：印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体抗原的亲和反应。即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在此特异抗体的二抗上，再分别用底物直接显色、测荧光、放射自显影等方法检测我们感兴趣的抗原，考虑到如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料，如丽春红，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。ⅠSDS-PAGE(见实验二Ⅱ)Ⅱ蛋白质印迹转移（电转移）仪器材料与试剂（一）仪器1.电泳仪2.半干式转移电泳槽3.脱色摇床4.恒温振摇器（二）材料与试剂1．电转缓冲液：48mmol/LTris-HCl，39mmol/LGLy，0.031%SDS，20%甲醇。2．TBS缓冲液(pH7.5)：0.02mol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl。3．TTBS缓冲液(pH7.5)：在TBS基础上再加入0.05%（v/v）Tween-20。4．封闭液：含5%（W/V）脱脂奶的TTBS缓冲液。5．PVDF膜6．DAB染色试剂盒7．山羊抗小鼠IgG－HRP8．抗MreB-GST多克隆鼠抗实验步骤1．电泳结束后，取出凝胶，切角做标记，浸泡于电转缓冲液中。2．剪取与凝胶等大的PV