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基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。2、基因工程（geneengineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restrictionenzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。11、DNA聚合酶：(1)、DNA聚合酶I：5’—3’外切酶活性、3’—5’外切酶活性，5’—3’聚合酶活性，用途：除去3’端突起。补齐5’端突起。合成cDNA第二链。切口移位探针的制备。(2)、Klenow大片段：没有5’→3’外切酶活性，而保留了5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。用途:用同位素标记具5’端突起的DNA片段末端。补平5’粘性末端。DNA序列测定。合成cDNA第二链。(3)、Taq酶：75度为最适反应温度，95度仍具有稳定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。12、主要修饰酶：(1)碱性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基团。(2)T4多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的γ位的磷酸基转移5’-OH上(3)末端脱氧核苷酸转移酶：在3’端高效添加脱氧核苷酸。分子克隆载体1、分子克隆载体：是一类可供外源DNA片段插入并携带重组分子进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。2、分子克隆载体的功能：（1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力（2）为外源基因提供在受体细胞中复制或整合的能力（3）为外源基因提供在受体细胞中扩增和表达的能力3、载体的分类：(1)按用途分：克隆载体、表达载体、整合载体(2)按来源分：原核生物载体：质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、cosmid载体、phagemid载体；真核病毒载体4、载体的特点：（1）至少有一个复制起点，因而至少可在一个生物体中自主复制（2）至少有一个克隆位点，可供外源DNA插入（3）至少有一个标记基因，以知识载体或重组DNA分子是否进入受体细胞（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数5、标记基因的作用：外源基因是否插入载体分子形成重组子；外源载体是否进入宿主细胞6、标记基因的种类：抗性标记基因；营养标记基因；生化标记基因；噬菌斑7、常用的遗传标记基因：四环素抗性基因（Tc）；氨苄青霉素抗性基因（Ap）；氯霉素抗性基因（Cm）；卡那霉素（Kan）；新霉素（Neo）；β—半乳糖甘酶基因（LacZ)；葡萄糖苷酸酶基因（Gus）；荧光素酶基因；发光蛋白质基因。8、按复制起点划分克隆载体：1）质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体（有低拷贝和高拷贝）2）ARS复制型—染色体复制型（一般拷贝数比较高）3）病毒复制型—复制起点来自病毒，若为RNA必须反转录为cDNA（高拷贝）4）混合复制型：不同种生物复制起点混合（穿梭载体）9、根据载体的分子生物学特性划分：质粒载体、病毒型载体、混合型载体10、根据载体功能分类：1）普通型载体：至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因。如PBR322和pUC载体2）表达型载体：3类：Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子；Ⅱ型：转录起始区+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子；Ⅲ型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）3）失控型质粒载体(Run-awayplasmidvector)：是一些低拷贝质粒，其复制控制是温度敏感型或药物敏感型，在不同温度或不同药物浓度下，质粒拷贝数会显著变化。4）探针型载体：该类载体主要特点是含有一些特殊的DNA序列，用于特定的研究目的，如分离基因启动子、终止子、DNA复制起点等。5)定序型载体：主要用于核苷酸的序列测定6)整合型载体：主要用于基因治疗，稳定表达外源基因。9、标记基因与拷贝的关系：若标记基因的表达效率较高，宿主细胞可能不大量表达标记基因以满足选择压力的要求，因而载体的拷贝数会降低，可采取相应方法提高拷贝数。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物的浓度。对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率。大肠杆菌分子克隆载体1、E.coli克隆载体的种类1）质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。2）噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。3）COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装4）噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。2、质粒的特点：1）质粒DNA的复制与染色体复制无关2）质粒DNA以超螺旋形式存在3）质粒DNA可以结合转移4）质粒的不相容性和不相容群5）质粒DNA的消除6）质粒的整合3、大肠杆菌质粒的复制：以RNAⅡ为引物合成，RNAⅠ与RNAⅡ结合可减少质粒的拷贝数，使RNAⅠ复制起点上游一个核苷酸处G突变为T，使得拷贝数增多。4、质粒的不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一宿主细胞中稳定共存的现象。主要是由于他们在复制功能之间的相互干扰造成。5、λ噬菌体的结构特点：线性双链DNA病毒，具有末端互补的12个核苷酸，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48.5kb。6、热诱导表达：λclts857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在λclts857下游，重组体的目的基因在42℃表达，30℃不表达。7、λ噬菌体载体的缺点：基因组太大；酶切点太多；野生型只能接纳一定长度的DNA。8、λ噬菌体载体的改造：切去非必须片段，加载目的基因去掉太多的酶切位点增加标记基因9、COS质粒载体的特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自λ的cos位点片段，双cos载体比单cos载体易于重组。10、COS质粒载体的优点：容量大，用于基因簇的克隆；形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染大肠杆菌细胞；操作简单，易于转化细胞；对重组DNA分子长度具有选择性包装。11、噬粒载体（phagemid）：在质粒载体中插入一段M13或fd的复制起点，其插入方向决定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链。基因操作的主要技术原理1、核酸分离提取的原则：保证核算的一级结构的完整性；排除其他分子的污染2、质粒载体分离的关键：如何使质粒与DNA与宿主染色体DNA分开依据：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程中，染色体断裂成片段，而质粒DNA仍保持超螺旋构型3、变性法提取质粒DNA的原理：在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。4、RNA分离纯化的关键：防止内外源RNase的作用5、RNase的特点：抗酸抗碱；抗高温严寒；抗变性剂，酶活性不需要辅助因子，存在范围广。因此操作时要进行高温灭菌或用焦碳酸二乙酯处理或强蛋白质变性剂等。6、核酸的浓缩：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的盐离子和杂质。7、核酸凝胶电泳的基本原理：核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子分离，分子量小的DNA，具有较紧密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢。8、核酸凝胶电泳常使用溴酚蓝作为指示剂、溴化乙锭作为染色剂9、脉冲场凝胶电泳原理：加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离10、双脱氧核苷酸终止法的原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列11、双脱氧核苷酸终止法的过程：制备单链DNA，与引物退火，分为4个反应体系，每个体系中加入dNTP和一种双脱氧核苷酸，DNA聚合酶定序反应，反应产物变性后电泳，凝胶干燥，放射自显影，根据条带读出碱基序列，再根据碱基互补配对原则写出DNA链的序列。（注意：要自己写一个序列，然后写上每个体系中出现片段的序列，然后根据序列画出电泳图，考试考的可能性大，书上有步骤）12、Maxam-Gilbert化学法原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，在碱性环境下硫酸二甲酯能使碱基G发生甲基化，在酸性环境下哌啶甲酸使A和G脱嘌呤，碱性环境下肼使C和T发生开环，在高盐浓度下肼只使C开环。然后发生1~2个碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列13、化学法测序的优点、不需要模板、引物和DNA聚合酶。14、Southern杂交（Southernblot）：用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。Southern杂交的一般步骤：DNA的制备→DNA酶切→电泳（琼脂糖凝胶电泳）→DNA原位转膜→探针杂交→放射自显影→结果分析15、Northern杂交检测的是RNA。步骤与southern类似，不需要酶切。16、Western杂交：杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS-PAGE中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测。主要用于基因表达产物蛋白质的检测。Western杂交的一般步骤：蛋白质制备→SDS-PAGE→电转移至膜上→一抗的制备→一抗与膜结合（1h）→洗膜（30min）→二抗与膜的结合→洗膜→显色反应→结果分析17、PCR反应体系：模板、引物、dNTP、buffer、taq酶、超纯水。18、引物设计的一般原则：引物的长度常为17至30个碱基；GC含量为40%至60%；Tm值高于55；两条引物之间配对碱基数小于5；引物自身配对的碱基数小于3。基因文库的建立1、基因组文库：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。2、建立基因组文库的一般程序:1)载体DNA片段的制备：DNA分离，限制酶切割，脱磷酸化反应2)供体DNA片段的制备：总DNA纯化，再进行机械或酶切割成特定大小的DNA片段。3)供体和载体DNA的连接: