基因治疗的现状与前景

基因治疗的现状与前景2003-9-9人类细胞基因治疗的临床实验已经开始。进行基因治疗必须具备下列条件：①选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；②纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；③该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；④具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。近三年来，已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。1．复合免疫缺陷综合征的基因治疗1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25％，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。2．黑色素瘤的基因治疗对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltratinglymphocyte-TIL,即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF／肿瘤细胞和IL－2／肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死因子（tumornecrosisractor,TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL－2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90％的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。3．其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。对于DMD的基因治疗，由于有小鼠动物模型，也取得一定进展。例如1993年法国将Ad-RSVmDys（腺病毒－罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体）注入小鼠肌内成功。即用腺病毒为载体，与小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因的cDNA重组，在RSV启动子启动下，作肌肉注射，证明可在mdy小鼠肌肉表达，此外，对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。我国复旦大学等单位对乙型血友病的基因治疗也进行了有意义的探索，他们在兔模型的基础上，将人第Ⅸ因子基因通过重组质粒（pcmvix）或重组反转录病毒（N2CMVIX）导入自体皮肤成纤维细胞，获得可喜的阶段性成果，相信不久的将来，基因治疗会在我国取得成功。图14－4反义DNA示意图4．反义技术又称反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotides）技术，是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段,使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的、用反义DNA已对某些癌症进行临床试验。这类反义技术只能认为是一种从基因水平进行治疗的技术，它们以不同方式，在DNA复制、转录和翻译水平发挥作用。由于它们的分子量低，故而有潜力进入靶细胞，但其临床稳定性、毒性、细胞通透性等各方面都需要进一步研究。5．药物靶向治疗（drugstargeting）此法机理可概括为病毒导向酶的药物前体治疗（virusdirectedenzyemeprodrugtherapy,VDEPT），即用反转录病毒载体的外源基因转移到细胞内.该基因编码一种酶，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒素复合物。带有这一基因的病毒载体只在特殊组织或肿瘤细胞中而不在正常细胞中表达。例如，胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase）可将无害的5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine,5-FC）转变为细胞毒素5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine,5-FC）。此病毒可感染正常细胞和癌细胞，但将该酶基因连接到一种“分子开关”后，则只能在肿瘤细胞中表达。Sikora等设计一个“嵌合小基因（chimericminigene）”，即将酶基因连接到erbB2基因启动子的下游，此启动子活性增强，使erbB2在乳腺癌细胞中过度表达。此时，药物5－FC注入细胞后即转变为5－FU而致癌细胞死亡。而当5－FC给予含有此嵌合基因却无erbB2表达的细胞时，亦无药物前体活性（图14－5）。这一基因治疗的新策略，可有可能使人对肿瘤等不同疾病进行基因治疗。图14－5病毒导向酶前药治疗示意图目前已批准治疗的病例约120例，其中约110例为肿瘤，遗憾的是，除黑色素瘤有些苗头外，全都未能成功。治疗了10余例单基因病，除ADA缺乏症和乙型血友病有一定疗效外，其余都还在实验阶段。但人们再也不怀疑基因治疗不仅可能办到，而且指日可待。基因诊断与基因治疗考点：基因诊断的定义及常用技术方法；基因治疗的定义、采用方法和基本程序。重点：基因诊断的概念和特点。基因诊断的常用技术方法：常用方法有①核酸分子杂交技术，包括限制性内切酶酶谱分析法、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析、等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）杂交法。②PCR。③基因测序。基因治疗的概念和常用方法：常用方法有基因矫正、基因置换、基因增补、基因失活、引入自杀基因。难点：基因诊断的方法及其原理，基因治疗载体的选择。一、基因诊断（一）基因诊断的概念和特点所谓基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。基因诊断的特点：①以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。②分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的特异性。③分子杂交和聚合酶链反应都具有放大效应，诊断灵敏度很高。④适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为外源基因。（二）基因诊断的常用技术方法1以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。常用有以下方法。（1）限制性内切酶分析法。此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。（2）DNA限制性片断长度多态性分析。在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断，称为限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLR按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。甲型血友病、囊性纤维病变和苯丙酮尿症等均可借助这一方法得到诊断。（3）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法。遗传疾病的遗传基础是基因序列中发生一种或多种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸；二是相应于正常基因碱基序的寡核苷酸，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变类型。2.聚合酶链反应(PCR)PCR技术采用特异的引物，能特异地扩增出目的DNA片段。由于在基因顺序中突变区两侧的碱基序列和正常基因仍然相同。因此。根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物，经PCR反应将目的基因片断扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。相同长度的单链DNA基因碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳动速率不同。PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在，这就是PCR/单链构象多态性分析。其他方法还有PCR/ASO法、PCR/RFLP法、PCR/限制性酶谱法。3分离出患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊断方法。（三）基因诊断的应用随着基因诊断方法学的不断改进更新，它已被广泛地应用于遗传病的诊断中。如对有遗传病危险的胎儿在妊娠和产前诊断的，杜绝患儿出生。基因诊断除用于细胞癌变机制的研究外，还可对肿瘤进行诊断、分类分型和愈后检测。在感染性疾病的基因诊断中，不仅可以检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体，既能确定既往感染，也能确定现行感染。对那些不容易外培养和不能在实验室安全培养（如立克次氏体）的病原体，也可用基因诊断进行检测。在传染性流行病中，采用基因诊断分析同血清型中不同地域、不同年份病原体分离株的同源性和变异性，有助于研究病原体遗传变异趋势，指导暴发流行的预测。基因诊断在判断个体对某种重大疾病的易感性方面也起着重要作用。基因诊断在器官移植组织配型中的应用也日益受到重视。基因诊断在法医学中应用主要针对人类DNA遗传差异进行个体识别和亲子鉴定。二、基因治疗（一）基因治疗的概念基因治疗是用正常的基因整合入细胞，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前从广义上来讲，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其体内发挥作用，以达到治疗疾病目的方法，也谓之基因治疗。目前基因治疗所采用的方法基本上可分为以下几种：1基因矫正指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。2．基因置换基因置换就是用正常基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。3．基因增补基因增补指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得到加强。目前基因治疗多采用此种方式。4．基因失活早期一般是指反义核酸技术。它是将特定的反义核酸，包括反义RNA，反义DNA和核酶导入细胞，在翻译和转录水平阻断某些基因的异常表达。近年来又有反基因策略、肽核酸、基因去除和RNA干扰技术。（二）基因治疗的基本程序1选择对疾病有治疗作用的特定目的基因是基因治疗的首要问题。对于单基因缺陷的遗传病而言，其野生型基因即可被用于基因治疗，如选用腺苷脱氨酶(ADA)基因治疗ADA缺陷导致的重症联合免疫缺陷综合症。2有病毒载体有非病毒体两类，多用病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。小结：常用病毒载体的比较逆转录病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体载体大小8.5kb36kb(大)5kb(小)核酸类型RNADNADNA外源基因容量＜9kb2～7kb＜3.5kb(小)重组病毒滴度中高较低靶细胞要求分裂细胞；表面须有特殊受体分裂或非分裂细胞分裂或非分裂细胞基因整合随机整合不整合定点整合于19号染色体长臂外源基因表达情况瞬时表达/稳定表达瞬时表达稳定表达基因转染效率高高不明安全性不明病毒蛋白可引起炎症和免疫反应无病原性3根据受体细胞种类的不同，基因治疗分为体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗两大类。4将基因导入哺乳动细胞的方法有两种：一是非病毒介导的基因转移；二是病毒介导的基因转移。非病毒介导的基因转移方法包括物理的和化学的方法等。物理方法有显微注射、电穿孔、DNA直接注射和基因枪技术等。化学方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体介导的基因转移等。导入基因的方式有两种：一种是间接体内疗法，即在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，以达到治疗的目的。其基本过程类似于自体组织细胞移植。另一种直接体内疗法，即将外源基因直接导人体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。5利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛选，只有稳定表达外源基因的细胞在病人体内才能发挥治疗效应。6将治疗性基因修饰的细胞以不同的方式回输体内以发挥治疗效果。人类基因治疗人类基因治疗的第一个认可的临床试验报告始于1990年9月，自此以来，已经