基因组学对抗菌药物的发现及毒物学的影响

13.基因组学对抗菌药物发现及毒物学的影响DorotheaK.Thompson,JizhongZhou刘妍译；张晓君初校；申剑、张晓君校对;13.1引言目前，由于微生物病原菌对抗生素抗性的日益提高，开发新型的抗菌药物应用于临床治疗的需求变得十分紧迫（Allsop,1998）。微生物快速地进行着进化和适应，很多微生物已经建立起一套对几乎所有种类的临床使用抗生素的抗性机制，越来越多的微生物具有多重的抗性系统，能够躲避或减轻抗生素的作用（GoldandMoellering,1996；Sefton，2002）。因此，目前新药开发的重点应该是开发具有新型作用机制的抗生素，而不是仍在已有的药物中研制类似的替代品。基因组水平的DNA序列信息为我们提供了空前多样的开发新药所需的潜在分子靶点，而且，那些新发展出来的遗传学技术也需要对很多环节进行研究，从最初阶段的分子靶点的选择到鉴定、优化、确认等环节进行研究，影响了新药研制和开发的进程（Cockettetal.,2000;见图13.1）。制药行业目前面临着一个重要的挑战，即在早期的开发阶段有效地对新化合物进行药物毒性进行评估。除了推进新药开发的过程之外，基因组学还能够通过降低研制新药时由于药物毒性导致的候选药物的高失败率这个途径来评估新药的安全性。（Lakkisetal.2002）。微芯片技术在药物开发领域的应用迅速得到扩展，其所涉及的领域现已包括基础研究、新药开发、生物标记的选择、药理学、毒物学、靶点选择以及预测技术的发展等（见Butte的综述，2002）。在这章中，我们将会讨论细菌基因组测序、生物信息学以及以基因组学为基础的技术在针对微生物感染的新药开发和毒物学研究这两个领域中所起到的作用。计算机基因组分析(如：比较基因组学、模体分析)和试验功能基因组学（如：微阵列、蛋白组学）的融合使新药的开发过程发生了改变，从原来直接的抗生素筛选过程转变为更为合理的以靶点为基础的筛选策略。在本章中，我们首先对抗生素的发现做了一个简单的历史回顾，接着讨论目前新药开发所面临的挑战，微生物基因组学对靶点识别所起的影响，以及基因组规模的试验技术在靶点确定和药物筛选方面得到的应用。最后，我们将对相关的毒物学问题进行探讨，如通过基因组学的资源对化学物质、环境污染物、候选药物的潜在毒性发生作用的分子机制进行确定。此外，我们还将举例说明，微阵列技术如何在转录组学水平为对潜在的药物毒性进行预测的分析过程提供一个理想的平台。（Nuwaysiretal.,1999）。13.2抗生素药物的发现：历史回顾诸如青霉素、头孢菌素、链霉素、杆菌肽等抗生素物质于十九世纪三十年代至四十年代陆续被发现，在制药行业开创了一个“抗生素时代”。随着将青霉素投入医学应用，其余大多数的抗生素都是通过从自然界物质文库（多数是土壤微生物的产物）中分辨其有无杀死或抑制细菌的能力来进行系统筛选而得到的。这样的筛选系统是对自然物质文库进行随机的筛选，因此是基于现象而不是基于目标的（VidalandEndoh,1999）。抗生素是微生物次级代谢的产物，次级代谢在药物发现的历史上占据了一个重要的位置。目前在医学上使用的药物有40％都来源于微生物和植物这样的天然资源，对于医学上重要的抗生素来讲，绝大多数来源于3个细菌和真菌的种：Streptomyces，Aspergilli，和Penicilli（Hutchinson,1998）。此外，目前用传统方法筛选已得到广泛应用的抗生素对一部分重要的细胞功能会产生抑制：（1）细胞壁肽聚糖的合成（β－内酰胺，糖肽）；（2）DNA或RNA的合成（醌，新生霉素，利福平，甲硝哒唑）；和（3）蛋白质合成（四环素，氯霉素，梭链孢酸）（Moiretal.，1999）。例如，四环素针对负责合成细胞蛋白的核糖体30S小亚基起作用，利福平通过作用于依赖于DNA的RNA聚合酶的β亚基来阻断RNA的合成(见Chopra的综述，1998)。然而，很多其他的重要细胞功能和代谢途径，如蛋白质分泌、信号转换、细胞分裂和其他很多代谢活动（如：能量的产生），并不为抗生素所抑制，因此是药物作用靶点选择的重要区域。在过去的30年中，为应对新型抗生素稀缺这一问题（HancockandKnowles,1998），对已有的抗生素的化学和结构水平进行合成修饰这种方法来应对新型抗生素稀缺这一问题（HancockandKnowles,1998）。另一方面，制药公司在新药开发和研制问题上总是习惯依赖于针对病理生理过程中那些已被详细研究的生化途径里的蛋白为作用靶点（Gmuender,2002）。被选为干涉治疗的靶点的通常是酶或受体。重要代谢途径中催化限速反应的酶被识别、纯化，然后用一组结构上有差异的小分子物质进行筛选，以确定对纯酶有抑制活性的引导分子（DebouckandGoodfellow,1999;Gmuender,2002）。如果不巧这种酶的活性机制已被阐明，那么用来筛选的化学物质文库就需要被限制在几种特定的小分子物质里。为了达到在离体的生化筛选中找到最优化的引导化合物的目的，药物化学家正致力于给那些潜在的有治疗作用的化合物赋予与药物相关的特性，如生物活性、对靶酶的高度特异性、抵抗微生物的活性、穿透细菌细胞的能力，以及无不良的药物反应（Gmuender,2002）。在这个新药开发和研制阶段，也就是指引导最优化（或有结构设计支持的化学合成）之后，接下来就是用动物模型进行在体的安全性测定。然而，有些情况下也有可能找不到任何引导化合物。在另一些情况下，能够在离体试验中找到选择性和敏感性都很好的引导化合物，但用在体动物模型验证后却因不良的生物利用率和稳定性被排除在外（Gmuender,2002）。此外，引导化合物的分子作用机制和毒性往往也没有得到很好的定义。虽然如此，传统的以生物化学为基础的筛药方法还是为我们提供了很多对抗多种疾病的有效的抗生素和有药效的物质。随着基因组学的出现，药物开发领域的发展开始进入了一个新的阶段。从历史上来看，靶点鉴定是药物开发过程中的一个主要障碍，因为潜在的抗感染的靶点数目是受已克隆的基因数目的限制的（Gmuender，2002）。目前已有的众多的基因组序列信息从实质上增加了可为新药开发和研制所利用的潜在的靶点数目。例如，据统计由于全基因组序列信息的爆炸，目前制药行业所使用的治疗效用的分子靶点已由1000个激增到10，000个（Deanetal.,2001）。基因组数据的整合，生物信息学分析、新的遗传学方法以及以基因组学为基础的技术（主要是微阵列技术）已经改变了传统的新药开发策略，使之从随机的筛选转变为更为合理的以靶点为基础的药物设计过程（Allsop,1998）。以基因组学为基础的新药的开发过程见图13.2。此外，与新药开发和研制过程相关的还有基础化学基因组学、遗传毒物学（将会在以后的章节中讨论）和遗传药理学在临床研究中的应用。化学基因组学的出现源于在靶点认证时将化学文库筛选和基因组学技术的综合利用（Cockettetal.,2002;Ward,2001）。在这些综合性的方法中，大量潜在的靶蛋白被用在标准化高通量的药物筛选测定中进行蛋白质互作的研究。基因组学和药理学的出现催生了一个新的分支学科，遗传药理学，这一学科致力于寻找可预测用药者对药物反应（如个人与个人之间的对药效和药物毒性的不同反应）的遗传学标记（如遗传多态性）（EvansandRelling,1999;Gmuender,2002）。遗传药理学的根本目标是将人类序列的多样性与药物代谢、副作用和疗效联系在一起（Harris，2000）。然而，还有一点需要着重指出的是，以基因组学为基础的新药开发和研制过程仍处于起步阶段，基因组学能在多大的程度上转化为药物研究领域的革新和生产力的提高仍然是未知的（Ward，2001）。在下面的部分中，我们将重点阐述微生物基因组学是如何使制药行业具有开发新型抗生素的能力的。然而，本章不涉及更深入的、对化学基因组学和遗传药理学的讨论。13.3新药开发所遇到的挑战目前，几乎所有的药用抗生素类物质都是通过半合理的最优化程序筛选出来的，这种程序很大程度上依赖于用全细胞筛选的方法从天然化合物中筛选出那些具有抗生素活性的物质（RosamondandAllop,2000）。这些有限的抗生素种类在临床上难以提供足够的分子多样性，一旦有抗性细菌的出现，就会导致这类抗生素的失效。目前，制药业所面临的巨大挑战是要研制开发出具有新型作用机制、至少在一段时间内疗效显著的新型种类的抗生素。已测序的基因组序列能为新药的研制与开发提供更多的潜在分子靶点。然而，挑战与优势是共存的，从众多的可用的靶点中挑选出最有希望的能使潜伏期和临床失败率下降的新靶点就是一种挑战。在这个部分中，我们简要地阐述了抗生素抗性的问题，并讨论了一下每种新型的抗生素被认定为具有疗效的准则。13.3.1抗生素的抗性和需要发现新型的抗生素临床上重要的微生物获得对抗生素的抗性机制是目前感染性疾病治疗中所面临的最大威胁。传统上，我们总依赖于通过随机筛选的方式或在抗生素上进行半理性（semirational）的修饰来开发新的药物，但这种方式不能产生足够的化学可变性以应对日益加剧的临床抗性（RosamondandAllop,2000）。细菌已发展出一套有效的抗性机制，使之能够在面对任何一种临床上使用的抗生素时都能存活下来（Allsop，1998）。其实，这种现象表明了微生物对临床上使用的任何一种抗生素，无论它的化学分类或分子靶点如何，都具有强有力的适应能力（Davies，1997）。这种微生物的适应性迅速蔓延，导致了在系统分类上多种革兰氏阴性和阳性感染细菌都产生了临床抗生素抗性。导致这个重要的公共健康问题的原因是，微生物具有在不同的菌株和种之间将这些抗生素抗性基因捕获或转移的能力（Davies,1994;Rowe-Magnusetal.,2002）。有证据表明，只要有时间和选择性压力，细菌对任何新的抗生素产生可遗传的抗性进化可能都是不可避免的（SilverandBostian,1993）。抗生素药物的抗性问题不仅仅是医院所面临的严重临床问题，也是一个严峻的社会问题（Cohen,2000）。在医院采样获得的Staphylococcusaureus菌株有超过40%都具有二甲氧基苯青霉素抗性，且日益增加的对二甲氧基苯青霉素的抗性菌株也表现出对万古霉素的抗性，而万古霉素是到最后阶段才使用的治疗药物。一些在医院发生的感染是由对万古霉素具有抗性的肠道球菌和对一氮二烯伍圜具有抗性的Candida引起的。具有多重抗性机制的肺炎球菌的出现也是一个值得担忧的问题。而Salmonella、Shigella、Neisseriagonorrheae和Mycobacteriumtuberculosis具有抗性菌株的出现亦渐渐引起社会的关注。很明显，目前十分紧迫的需求是开发具有新颖结构的对现有的微生物抗性机制不敏感的药物，只有这样才能预防抗性细菌的出现。这是21世纪制药行业所面临的最大挑战。提高微生物对抗生素抗性的一个方法是集中研究那些具有能够赋予抗药性表型的分子机制。整合子（integons）是不同革兰氏阴性细菌中多重抗生素抗性决定因子捕获和传播的重要手段（Rowe-Magnusetal.,2001,2002）；然而，质粒和转座子能影响抗生素抗性基因的流动性。整合子是包含有位点特异性重组系统的遗传元件，使基因的捕获和流动成为可能（HallandCollis,1995）。一个整合子可以包含一个单一的抗生素抗性基因或多个抗性基因位点，因此可以产生多重抗药性。整合子中含有的启动子可以使这些基因位点所编码的蛋白得到表达，这样就组成了整合子天然的复制和表达系统(HallandCollis,1995)。整合子的基本结构包括：整合酶（intI）——介导了临近位点（attI）和第二位点（attC）间发生位点特异性重组，这种位点特异性重组往往与某个基因相关（通常是抗生素抗性基因）。该attC-ORF的结构就是一个基因盒（genecassette）。由整合子介导，在attI和