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1THERNAiCOMPANYRNAi产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd.2Ⅰ.RNAi简介1A.RNAi实验原理B.RNAi实验流程C.RNAi实验所需试剂D.上海吉玛RNAi相关产品Ⅱ.siRNA设计7A.哺乳动物siRNA设计B.上海吉玛siRNA产品特性C.siRNAoligo技术数据Ⅲ.siRNA对照9A.普通阴性对照B.荧光标记的阴性对照C.siRNA阳性对照D.转染试剂对照E.避免off-target对照Ⅳ.siRNA转染10A.siRNA转染的方法B.RNAi-Mate转染试剂C.RNAi-Mate适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.RNAi-Mate：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I.体内siRNA导入方法J.siRNA转染常见问题与建议Ⅴ.mRNA水平RNAi效果监测15A.siRNA细胞转染条件优化B.Real-TimePCRRNAi效果检测C.Real-TimePCR结果分析Ⅵ.蛋白质水平RNAi效果监测20A.western-blot原理3B.western-blot操作步骤C.western-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ.RNAi实验常见问题解答22Ⅰ.RNAi简介A.RNAi实验原理RNA干扰（RNAinterfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。4B.RNAi实验流程靶基因确认(TargetGeneIdentification)siRNA设计（siRNADesign）RNAi结果检测(MeasureKnockdown)siRNA的转染(siRNATransfection)(siRNAGeneration)siRNA的制备功能研究（FunctionResearch）5C.RNAi实验所需试剂试剂种类试剂用途siRNAoligo与您所要敲除靶基因的转录本（mRNA）完全互补转染试剂如脂质体法，lipofectamin2000(invitrogen)，上海吉玛的转染试剂RNAi-Mate，电穿孔法等实验对照包括阴性和阳性及Mockingcontrol基因表达的检测方法如mRNA水平检测用qRT-PCR；蛋白表达水平检测用westernblotD.上海吉玛RNAi相关产品普通siRNAOligo上海吉玛siRNAOligo是在ISO9000质量标准下生产并经过了反复优化和严格测试；产品质量高度稳定，以退火双链RNA冻干粉的产品形式提交给用户。化学修饰siRNAOligo上海吉玛化学修饰siRNAOligo不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与标准siRNA作用时间相比，上海吉玛化学修饰siRNAOligo的作用时间可延长一倍左右。荧光标记siRNAOligo荧光标记siRNAoligo可用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到，可直观地观察siRNA转染效率，优化转染条件；荧光标记的siRNAoligosiRNA还可用于siRNA细胞定位及双标实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达结合起来。6siRNA阴性对照上海吉玛RNAinegativecontrol与哺乳动物基因无同源性，作为实验的阴性对照，同时通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件。荧光容易拍摄，它有很好的pH耐受性，因而在活细胞中更稳定。siRNA阳性对照上海吉玛RNAipositivecontrol用于确定实验中转染、RNA提取和检测方法的可靠性。上海吉玛提供的阳性对照包括LaminA/C、GFP22、LuciferaseGL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、CyclophilinB等。siRNA转染RNAi转染试剂RNAi转染试剂是一种基于脂质的转染试剂，专门用于转染，确保没有RNAse活性，细胞毒性低。适用细胞广泛；可在含有抗生素的完全培养基中转染；即用型试剂，不必更换培养基，操作简便易行，重复性好，可在半小时内完成操作；介导siRNA高转染细胞和体内高效导入，即使在含血清培养基中也能表现高转染效率；4℃下可长期保存。RNAi表达载体法shRNA表达载体上海吉玛shRNA表达载体的特点是：克隆载体具有两种形式的克隆酶切位点BamH1和Bbs1，可形成非对称互补粘末端，保证插入片断的方向正确，有效避免载体自体连接；多种筛选标记确定稳定转染细胞系；GFP报告基因帮助评价转染效率并指示RNAi发生位点。上海吉玛现可提供8种shRNA表达载体，详见公司总目录C-6页。EzolRNAExtractionReagentEzol试剂是用于总RNA抽提的试剂，适用于人类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA提取；无论是小量的细胞（5×106）或组织（50-100mg）还是大量的细胞（107）或组织（1g）都可得到出核酸抽提色的结果；操作简便，可实现RNA的快速抽提。EnzolRNAExtractionReagentEnzol试剂是用于哺乳动物基因组DNA抽提的试剂，适用于组织、单层或悬浮细胞的基因组DNA提取。通常使用本试剂，从20毫克组织可以抽提到约40微克基因组DNA，从106-107Hela细胞可以抽提到约25微克基因组DNA，是一种简单、快速、高效、经济的方法。RNAi-StartupGAPDHControlKit本试剂盒可以用来优化siRNA转染条件，也可作为RNAi实验的内参使用。荧光标记的dsRNA可直观地观察细胞转染情况；包含GAPDHsiRNA阳性对照和阴性对照；应用Real-TimePCR方法准确评价转染前后GAPDH基因的RNAi抑制情况；为优化转染条件提供直观依据。RNAi-StartupGAPDHBasicControlKit荧光标记的dsRNA可直观地观察细胞转染情况；包含GAPDHsiRNA阳性对照和阴性对照；应用Real-TimePCR评价转染前后GAPDH基因活性时,本试剂盒适用于Real-timePCRCoreReagent7（目录号QSG-070）。RNAiGene-KnockdownEasyKit使用本试剂盒可以完成从“向细胞中导入siRNA及转染效率评价”到“实时RT-PCR验证RNAiKnockdown效果”的全部过程；荧光标记的dsRNA可直观的观察细胞转染情况；内含GAPDHsiRNA基因表达检测阳性对照和阴性对照及PCR扩增引物和探针，可应用定量PCR方法直观评价转染效率及验证GAPDH的RNAi抑制效果；可作为RNAi实验的阳性和阴性对照使用。RNAi-StartupIFNResponseBasicControlKit哺乳动物细胞中长链的双链RNA（dsRNA）能够诱导干扰素效应，引起非特异性的转录抑制。如果您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异性的IFN效应，则可用本试剂盒进行验证；应用Real-TimePCR检测非特异性IFN效应时，本试剂盒适用于Real-timePCRCoreReagent（目录号QSG-070）。RNAi-StartupIFNResponseControlKit如果您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异性的IFN效应，则可用本试剂盒进行RealtimePCR验证；同时检测PKR,OAS-1和hStat1三个IFN效应基因并提供GAPDH管家基因对照；检测灵敏度高，结果直观且易于判断。常备的RNAi管家基因Control试剂盒上海吉玛制备了一些常用管家基因的RNAi实验ControlKits，以方便广大科研工作者开展RNAi实验。详见上海吉玛产品目录荧光定量PCR分册C8页。Ⅱ.siRNA设计A.哺乳动物siRNA设计8哺乳动物siRNA设计需要注意的几个方面基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因1．从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，序列的选择。目的序列可以随机选择也可以并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链通过在目的基因的不同区域上测试不同的序和反义链都采用这19个碱基(不包括AA重复)来设计。列以决定何种序列是最有效的。2．避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。3．siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。4．在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。5．将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。6．将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（）。7．选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。8．阴性对照:一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。9．有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别，因为这个突出端无需和靶序列互补。合成siRNA时可直接提供以AA打头的21个碱基序列。B.上海吉玛siRNA产品特点9上海吉玛拥有处于国际领先水平的siRNA化学合成的全部核心技术，包括RNA单体合成、普通siRNA合成、化学修饰siRNA合成、荧光标记siRNA合成等。siRNAoligo合成是在ISO9001质量标准及严格控制的流程和条件下完成的，确保了产品质量的高度稳定。化学合成siRNA有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。化学修饰的siRNAOligo不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时也延长了siRNA的作用时间。C.siRNAoligo技术数据与siRNA相关的一些技术数据及注意事项1．siRNA的平均分子量13,300。2．siRNAoligo的OD、nmol和质量间有相应的公式可以计算；一般情况下，对于一个21bp的siRNAoligo，有如下简单关系：1ODduplex＝3.0nmols＝40ug3．1OD的siRNA欲溶解为20uM的样品，可用150uLDEPCH2O去重悬1OD的siRNA，溶解后为20uM的样品。4.由于OligoRNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时请加足量DEPC水后盖上管盖，振荡溶解。5．荧光标记的RNA，如FAM、HEX、TAMRA等标记的Oligo因为对光敏感，必须避光保存。上海吉玛siRNA产品特性质量控制siRNAoligo合成是严格控制的流程和条件下完成的；在ISO9000质量标准下生产；产品经过分光光度计精确定量。纯化HPLC纯化；全长双链siRNA含量97%标记和修饰在3'和5'末端标记生物素、荧光素和磷酸等更加方便监测siRNA的抑制特异基因表达的效果长度19～23碱基/链储存和稳定性建议在-20°C的