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基因工程总结第三章基因克隆的酶学基础限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。Ⅱ型核酸内切限制酶的基本特性：（i）识别特异性序列；（ii）2个单链断裂部位在DNA分子上通常不是彼此直接相对的；（iii）断裂形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。酶切位点：绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的碱基序列，它们双重旋转对称(回文结构)。即为酶切位点。粘性末端，是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。具平末端的DNA片段则不易于重新环化。同裂酶（Isoschizomers）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶（Isocaudamer）：来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。核酸内切限制酶的命名法名称字母来源含义EEscherichia（属）cocoli（种）RRY13（品系）I首先发现在此类细菌中发现的顺序影响核酸内切限制酶活性的因素1.DNA的纯度2.DNA的甲基化程度3.酶切消化反应的温度4.DNA的分子结构5.核酸内切限制酶的缓冲液DNA连接酶（ligase）：在一条DNA链的3′末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5′-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在两条DNA链之间形成的磷酸二酯键。作用方式：DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick），即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口（gap），即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。连接酶有两种不同的来源：一种是由于大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶，另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶（可以催化平端连结）。前者用NAD+作能源辅助因子，后者用ATP作能源辅助因子。作用的分子反应过程可分三步：①NAD或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。②将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5'-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;③这个被激活的5‘-磷酰基端可以和DNA的3’-OH端反应合成磷酸二酯键（连结），同时释放出AMP。平末端DNA片段的连接：常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。末端脱氧核苷酸转移酶：它能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。热稳定的DNA连接酶（thermostableDNAligase），是从嗜热高温放线菌（Thermoactinomycesthermophilus）菌株中分离纯化的，一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶。DNA聚合酶的共同特点在于，它们都能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP)连续地加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况PolⅠ酶有三种不同的酶催活性：①5′→3′的聚合酶活性②5′→3′的核酸外切酶活性(仅仅限于匹配的双链)3′→5′的核酸外切酶活性（单、双链均可，发生聚合酶活性的时候，3′→5′的核酸外切酶活性是受抑制的）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（E.coliDNAPolⅠKlenowfragment），又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶。主要用途为：（i）修补经限制酶消化的DNA所形成的3′隐蔽末端；（ii）标记DNA片段的末端；（iii）cDNA克隆中的第二链cDNA的合成；（iv）DNA序列测定。末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT），简称末端转移酶，具有5′→3′方向的聚合作用，不需要模板的存在就可以将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3′-OH末端。末端脱氧核苷酸转移酶的其它应用•催化[a-32P]-3’-脱氧核苷酸标记目的DNA片段的3’-末端。这种修饰过的核苷酸由于没有3’-OH，故使得目的片段会终止延伸•催化非放射性的标记物掺入到目的DNA片段的3’-末端。例如生物素-11-dUTP等•按照模板合成多聚脱氧核苷酸的同聚物。多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端，当使用γ-32P标记的ATP作前体物时，可以实现目的序列的同位素标记碱性磷酸酶：催化核酸分子脱掉5′磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5′-P末端转换成5′-OH末端在DNA体外重组中，为了防止线性化的载体分子发生自我连接作用，也需要从这些片段上除去5′-P基团。核酸外切酶（exonucleases）：是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。ExoⅦ能够从5′-末端或3′-末端降解单链DNA分子，产生出2－12bp寡核苷酸短片段。是一种不需要Mg2+离子的核酸酶。ExoIII主要活性是，按3′→5′的方向催化双链DNA自3′-OH末端释放5′-单核苷酸。主要应用是，通过其3′→5′活性使双链DNA分子产生出单链区。λ核酸外切酶λexo催化双链DNA分子自5′-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5′单核苷酸，但它不能降解5′-OH末端。用途一，将双链DNA转变成单链的DNA，供测序使用；第二，从双链DNA中移去5′突出末端，以便用末端转移酶进行加尾。S1核酸酶：催化RNA和单链DNA分子降解成为5′单核苷酸。同时它也能作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子Bal31核酸酶既具有单链特异的核酸内切酶活性，同时也具有双链特异的核酸外切酶活性。Bal31核酸酶与限制位点的确定其主要用途包括：（i）诱发DNA发生缺失突变；（ii）定位测定DNA片段中限制位点的分布；（iii）研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构。第4章基因克隆的质粒载体细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子，有一个例外之一是酵母的杀伤质粒成分是RNA质粒。基本特征：•独立于宿主染色体•自主复制的遗传成份。•环形双DNA可以持续稳定地处于外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代构型：1.共价闭合环形DNA(covalentclosedcircularDNA，cccDNA)：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，通常呈现超螺旋构型；2.开环DNA(opencircularDNA，ocDNA)：两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，呈现开环构型；3.线性分子(linearDNA，IDNA)：若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性，通称线性构型。质粒的三个基本原件：经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都至少包括三种原件，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点质粒拷贝数：在标准的培养基条件下，每个细菌中所含有的质粒DNA分子的数目。质粒的不亲和性/不相容性（plasmidincompatibility）是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定地共存。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥掉。.质粒DNA拷贝数的控制：高拷贝质粒倾向于在松弛控制下进行复制，其复制的启动是由自身编码的蛋白来控制；低拷贝质粒通常是在严禁控制下进行复制，受到宿主细胞的蛋白（复制起始蛋白）控制，且与宿主细胞染色体同步进行。质粒复制控制的分子模型抑制蛋白质稀释模型（inhibitordilutionmodel）自体阻遏蛋白质模型（autorepressormodel）质粒DNA的分离与纯化：通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌细胞裂解；从清亮裂解液中纯化质粒DNA：1.氯化铯密度梯度离心法；2.碱变性法；3.微量碱变性法影响质粒DNA产量的因素1）寄主菌株的遗传背景2）质粒的拷贝数及分子大小质粒载体的构建及类型天然质粒,一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。质粒载体必须具备的基本条件具有复制起点具有抗菌素抗性基因具若干限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较高的拷贝数质粒载体的选择记号载体质粒的类型高拷贝数的质粒载体：适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。低拷贝数的质粒载体：适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA失控的质粒载体：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。正选择的质粒载体这种质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量表达型的质粒载体使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-翻译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体pSC101质粒载体低拷贝数，1~2份，分子量为9.09Kb四环素抗性基因（tet）。EcoRI等多个单克隆位点第一个成功应用于真核DNA克隆的载体（1973）pBR322质粒载体的优点具有较小的分子量。4363bp。具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322DNA分子内具有多个限制酶识别位点。具较高的拷贝数，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。典型的pUC系列的质粒包括：来自pBR322的复制起点（ori）氨苄青霉素抗性基因（ampr）lacZ检测系统多克隆位点（MCS）丧失迁移功能的质粒——pBR327①拥有较高的拷贝数，平均每个大肠杆菌寄主细胞可达30~45份；②由于失去了bom位点，不能提高结合而转移，具有更高的安全系数。能在体外转录基因的质粒载体——pGEM-3Z穿梭质粒载体：所谓的穿梭质粒载体是指一类人工构建的，具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌和动物细胞之间的穿梭质粒载体，如利用大肠杆菌和牛乳头瘤病毒构建的pBPV-BV1。第5章噬菌体载体和柯斯载体噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫做Bacteriophage（简称phage）。它的DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA三种不同的基本结构：无尾部结构的二十面体具尾部结构的二十面体（居多）线状体型。噬菌体的核酸类型双链线性DNA（最常见）双链环形DNA单链环形DNA单链线性DNA单链RNA噬菌体的DNA碱基不绝对是由标准的A、T、G、C四种碱基组成。T4噬菌体DNA中没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）；SSP01噬菌体DNA中T碱基被5-羟甲基尿嘧啶（HMU）取代噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期①温和噬菌体（temperatephage）：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。②溶源性细菌（lysogen）：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫做溶源性细菌。如果有某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能够完成其溶菌周期，故含有这种噬菌体的细菌叫做缺陷