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国家自然科学基金申请讲座医教部苏景宽二○○三年一月第一部分基金委面上项目评审基本程序及重要环节初审：由各学科处组织实施。①申请者不具备申请资格或违反有关规定；②手续不完备或申请书不符合要求;③内容不符合资助范围或超出资助能力;④申请者以往资助项目执行不利。查重：由基金委信息中心组织实施。①高职申请与承担（含参加）面上、重点、重大累计不超过3项；②在职研究生不作为限项申请的条件但只可申请面上项目；③申请者同期只能申请一项，每个项目申请者限为一人;④高职申请者当年申请及承担的在研面上项目累计不超过两项;⑤不具有高职的申请者申请及负责的在研面上项目不超过一项;⑥青年基金只能获得一项资助。同行评议（一审）：由基金委各学科处组织实施。基本程序：每份申请书选择同行评议专家（5位）；函请同行评议：对项目进行定性定量评价；收回评议卡；对定量部分进行计算机判读、打分、排序；据学科资助项目数130％确定第二轮评审项目。专家评审组或专业委员会评审（二审）。主要对一审推荐项目进行评议，筛除30％。再次对二审会确定资助项目进行审查：进一步查重；以往承担项目是否按期完成；是否有违反基金委有关申请规定。基金委员会委务会审议。下发批准、未批准通知。第二部分如何撰写国家自然科学基金申请书一、摘要（限400字）包括：研究方法、内容、目标、科学意义等如：“用……方法（手段）进行……研究，探索/证明……问题，对阐明……机制／揭示……规律有重要意义，为……奠定基础／提供……思路”采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。通过基因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，观察细胞的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的变化，研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。二、立论依据对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目科学意义对应用基础研究，着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题论述其应用前景在研究领域（疾病防治）层面从研究方向展开围绕本项目拟解决的问题进行归纳分析提出设想从研究领域（疾病防治）切入研究意义1、项目的研究意义存在问题：对科学意义阐述不足或夸大。撰写方法：从疾病入手，简述其特点、危害，目前主要的治疗方法及其存在的问题。简要分析该病发病机理和主要研究热点，引出目前存在的主要问题，也就是本项目要解决的问题，以此为切入点提出假设，阐述如果实现预期目标，对该病甚至相关疾病的预防、治疗具有的理论意义和临床价值。老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化，白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类第一位的致盲疾病。迄今为止,治疗白内障唯一有效的方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的发病时间延缓10年，白内障手术的数量就会减少45%[1]。所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济问题[2]。但是目前我们对老年性白内障发病机理的认识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能抓住引起白内障发生、发展的主要环节。据此，本研究拟利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明白内障的发病机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。2、国内外现状分析（综述）存在问题：文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，提出的问题别人已解决---低水平重复。对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，缺乏实际应用的可行性---无法实现预期目标。---已有方法与掌握方法的人的结合；---方法理论上可行与现实可行性的结合。对国内外现状只是简单罗列，缺乏归纳分析，缺乏逻辑性和针对性---总结与表达不够。(撰写方法：要紧紧围绕本次申请项目的主题。1、从疾病切入，简要论述国内外研究成果，并引出当前的热点研究方向。2、从研究方向展开，较详细地分析国内外在本方向的研究进展，引出阐明疾病发病机理或发明新的治疗方法的关键问题所在。3、围绕关键问题，详细论述国内外以往的研究结果、当前的现状及今后的发展趋势。综合分析后提出目前尚未解决的问题。4、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究的依据。新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究的理论依据和实验依据。要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清楚，绝不能是一种简单的移植。例如：单链抗体+功能基团，理论上可以实现融合，但存在“活性、表达载体选择、纯化”等问题。5、提出本项目的研究设想。防治白内障必须针对其发病的主要环节。多年以来，国内外学者从不同的角度探讨白内障的发生机理。就致病的环境因素讲，氧化因子、紫外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障的发生有关。就研究的部位分，晶状体中皮质与核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的晶状体上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性、数量相对稳定的细胞，它们分裂、分化出晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息，形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体的透明起重要作用。不仅如此，晶状体上皮细胞还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，已有研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞还发生退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单纯老化的晶状体之间存在差异[3-5]。体外实验也证实多种因素(H2O2、UV-B、晶状体蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中晶状体上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节[6-8]。因此，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所在，也是有待我们深入研究的问题。白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组织特异性多种基因表达的改变。目前，国内外对白内障相关基因的研究主要以下三方面：一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮细胞的研究。UV-B辐射作用诱导的白内障中晶状体上皮细胞是主要的靶细胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表达增加；还有组蛋白H4、H3的低表达`和蛋白酶C、β-肌动蛋白、γ-肌动蛋白基因的高表达[9-12]。Carper等[13]利用RT-PCR-DD(reversetranscription-polymerasechainreactiondifferentialdisplay)技术研究H2O2诱导的晶体上皮细胞的基因差异性表达结果显示NADH脱氢酶4亚基、细胞色素b、谷氨酰胺转移酶基因表达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子2（alternativesplicingfactor）、β-三羟基异丁酰辅酶A水解酶基因表达的增加。二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白基因（vimentin）、杂交的Ⅲ型中间纤维蛋白基因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠年龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同特点是晶状体纤维细胞分化受抑制[14,15]。Gong等[16]报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白α3（α3Connexin）基因敲除小鼠（knockoutmouse）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早期不受影响，其后出现与晶状体蛋白溶解有关的核性白内障。虽然体外实验和白内障转基因小鼠都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有关，目前尚缺乏进一步的报告。三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。Lee[17]利用RT-PCR技术研究显示前极性白内障与核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、I型胶原纤维、α-平滑肌蛋白、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βⅡ型受体、结缔组织生长因子的基因表达有差异。Kantorow等[18]利用RT-PCR-DD研究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和12个低表达的基因。但就DD-PCR技术来讲，在实验中难以解决假阴性、假阳性以及克隆全长cDNA的问题。上述三方面的研究均取得了不同程度的研究结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相关的基因及其功能。寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术（subtractivehybridization,SH），它是……，但是实验操作复杂。经过改进后的抑制性消减杂交（suppressionsubtractivehybridization,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）……简化了实验操作，但仍然问题很多。我校生化教研室建立了改良消减杂交技术[19，20]，其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，并克隆到全长cDNA，为进一步的结构和功能研究打下基础。基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在1996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的DNA探针集中到1厘米见方的基片上，利用碱基互补原理，DNA探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNA分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知DNA分子。由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达的所有基因建立cDNA文库，再利用基因芯片技术制备成基因芯片，以此检测多个样本中白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，从中进一步筛选出白内障特异的基因，它们中可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地得到白内障相关基因。综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。注意事项注意逻辑性和层次感，并随时点题。文字表达要精雕细琢，避免假大空。参考文献必须提供作者全名、出处。参考文献必须引用02年甚至03年的文献。要注意参考国内相关专业知名专家的论著。文献回顾不能回避国内外最新研究进展。三、研究方案1、研究目标存在问题：目标过大撰写要求：有限目标，与研究内容相呼应如：探索……问题，明确……关系，揭示……规律，阐明……原理（机制），建立……方法等研究目标：筛选出与老年性白内障相关的基因，明确部分基因在白内障形成中的作用，从