壬基酚对家兔丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶的影响

壬基酚对家兔丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶的影响壬基酚对家兔丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶的影响摘要：本试验以被喂养壬基酚的不同月龄家兔作为试验材料，通过家兔不同器官中丙二醛及其谷胱甘肽过氧化物酶含量的测定，来分析壬基酚对于家兔的影响。结果表明：家兔血浆、肌肉、肝和肾中丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶含量发生了不同程度的改变，壬基酚可影响机体的抗氧化防御系统。关键词：壬基酚；家兔；丙二醛；谷胱甘肽过氧化物酶InfluenceOfNonylphenolOnMalondialdehydeAndGlutathionePeroxidaseOfTheRabbitAbstract：Thisstudywasmainlyaimedtoevaluatetheeffectofnonylphenoltothemalondialdehyde(MDA)andglutathioneperoxidase(GPX)oftheRabbit.One-，three-andfive–month-oldrabbitswererandomlydividedintocontrolgroupwhichwasadministeredbywaterwithoutanychlorineandexperimentgroupwhichwasadministeredby0.5mg/Lnonylphenolsolution.Thereweresixrabbitsineverygroup.After21days,therabbitswerekilledforthesamplingofplasma,liver,muscleandkidney.TheresultsshowedthattheconcentrationofMDAandtheactivityofGPXwerechanged,andthereforenonylphenolcanalterlipidperoxidationandtheantioxidantdefensesystem.Keywords：Nonylphenol;Rabbit;Malondialdehyde;Glutathioneperoxidase目录前言......................................................................................................11.材料与方法.......................................................................................21.1动物材料.......................................................................................21.2试验方法........................................................................................22结果与分析.......................................................................................32.1壬基酚对不同月龄家兔MDA的影响结果...................................52.2壬基酚对不同月龄家兔GPX的影响结果.....................................53讨论...................................................................................................53.1壬基酚对不同月龄家兔MDA的影响...........................................53.2壬基酚对不同月龄家兔GPX的影响............................................6参考文献..............................................................................................7致谢....................................................................................................10前言壬基酚（Nonylphenol，NP）是一种新近认识的环境内分泌干扰物，被广泛的应用于工业生产中，例如清洁剂、油漆、杀虫剂的生产，还可作为工业生产中的抗氧化剂以及一些个人护理用品的乳化剂，少量壬基酚被应用于食品包装方面透明塑料膜的制造。壬基酚的化学性质稳定，难降解，研究证实壬基酚在60℃的有氧环境中可以经微生物降解，但在无氧情况下壬基酚仍难于降解[1]。由于壬基酚的脂溶性和难降解的特点，水生生物可作为其富集的贮存库[2]。一方面通过水体的传递积累于生物体内，另一方面通过食物链的传递而发生放大作用[3]。壬基酚在河水、水生附着生物和底栖生物之间的生物积累与放大倍数在18-1200倍之间。而底栖生物的相对最大积累率可达106倍，环境激素通过食物链的生物放大作用比通过水体的传递对鱼类等水生生物的危害更大[4]。如大西洋鲑（Salmosalar）可以通过洄游将环境雌激素转移到阿拉斯加淡水湖泊，从而使环境雌激素浓度高出其他湖泊2倍[5-6]。在生态系统中，这类物质通过生物浓缩、生物积累和生物放大等途径增大浓度，实现对生物和人类的更大危害。壬基酚可对生物体产生广泛的不良作用。近几年来通过体内外试验研究发现，壬基酚对啮齿类动物的多种器官、系统存在毒性作用，其中对于生殖系统的研究比较透彻。当壬基酚剂量为250mg/（kg·d）时，经口给予啮齿类动物时可引起明显的睾丸损害，壬基酚能降低雄性大鼠生殖系统附睾的重量，导致精子密度和睾酮水平降低与促黄体素、促卵泡素水平的增加，并且精巢中细胞凋亡的数目随着壬基酚浓度的增加而增加[7]。壬基酚可以通过模仿或是调节内源性激素系统影响正常的脑功能。Obata等研究发现壬基酚可以通过雌激素受体的作用，诱导大鼠纹状体内羟自由基（·OH）的形成[8]。在体试验进一步证明了壬基酚对于中枢神经系统的正常功能有一定干扰作用。通过对卵巢切除大鼠皮下注射剂量为50mg/（kg·d）的壬基酚发现，壬基酚能够通过影响孕激素受体系统改变皮质功能[9]，也能够通过影响腺垂体水平，抑制卵巢切除大鼠促黄体素的分泌[10]。在免疫系统中，体内和体外细胞试验都证明壬基酚能通过改变胸腺细胞Fas和FasL的表达诱导细胞凋亡来影响免疫功能[11、12]。壬基酚还可通过激活caspase-3以及线粒体去极化诱导胸腺细胞的凋亡[13]。除了对生殖系统以及免疫系统的毒性研究以外，壬基酚还被发现可以作为细胞转化的助剂，导致体内癌症的发生[14]，诱导成熟大鼠急性肝毒性作用[15]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂质过氧化的最终分解产物之一,其含量变化可在分子水平上指示生物体的氧化损伤程度[16]。因此通过检测机体内MDA含量变化，可以直接反映出机体内脂质过氧化的程度，而且能间接的反映出机体细胞受自由基攻击损伤的程度[17]。生物体抗氧化酶防御系统主要包括超氧化物歧化酶（Superoxide-2-dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GlutathionePeroxidase,GPX）等，其主要功能是清除活性氧自由基[18-21]。谷胱甘肽过氧化氢酶（GPX）是生物机体内重要的抗氧化酶之一，它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂[22]。在机体清除自由基的过程中，抗氧化酶起着重要的作用。GPX能催化H2O2和脂质过氧化物还原，防止脂质过氧化物对机体生物膜和组织的损伤，并防止脂质过氧化物进一步水解为有害物质MDA。因此MDA和GPX的含量变化可在分子水平上指示生物体的氧化损伤程度[23，24]。毒理学研究表明生物体GSH和MDA含量变化对化学物质反应灵敏，且测定简便、不易受分析条件影响，常作为化学物质生态毒性的评价指标[25，26]。王志成[27]等人发现氟中毒会使体内起抗氧化作用的SOD、GPX等酶的生物活性受抑制，使自由基在体内大量蓄积而致脂质过氧化作用增强。众多试验研究也发现氟可对动物多种组织产生脂质过氧化损伤[28-34]。目前有关壬基酚的研究主要集中在对于内分泌、生殖和发育、促癌作用、免疫影响等方面，而关于壬基酚对动物机体理化的影响尚未见报道。因此本试验以家兔为试材，检测喂养了壬基酚的家兔体内MDA及GPX含量的变化，为进一步深入研究壬基酚对动物机体影响的研究提供参考依据。1材料与方法1.1动物材料试验所用健康成年家兔均购于大庆春蕾饲养场，用长春希望兔饲料喂养。1.2试验方法1.2.1动物材料的处理健康家兔36只，1月龄、3月龄和5月龄各12只。饲养室预饲养一周后随机分成对照组和处理组，每组6只。对照组喂养除氯自来水，处理组喂养0.5mg/L壬基酚溶液，喂养21天。1.2.2动物采样和样品制备速眠新Ⅱ麻醉家兔：家兔肌肉注射速眠新Ⅱ，注射后5-10分钟麻醉。如果第一次给药量不足，可再加大给药剂量，使其麻醉。心脏取血：将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛剪去，用碘酒酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器中。取得所需血量后，迅速将针头拔出，将血液转入肝素处理的离心管中。组织采样：注射过量麻醉剂处死家兔，再解剖取出肝、肌肉和肾。血液样品制备：将取出的血液3000r/min离心10min，取血浆，装入离心管中液氮速冻后置于-70℃冰箱保存，以待用于生化指标的测定。-3-组织块样品制备及处理：将取出的组织块剪碎混匀后装入离心管中，经液氮速冻后置于-70℃冰箱保存，以待用于生化指标的测定。测定前，取出组织块，称取肌肉、肝、肾分别为1g、0.5g、1g，将其置于研钵中研磨后用于冷的0.9%生理盐水稀释匀浆，制成的组织匀浆浓度分别为10%、20%、20%。将组织匀浆3000r/min离心10min取上清，用于生化指标的测定。1.2.3丙二醛含量的测定参照测试盒说明书提供的方法，制备标准管，标准空白管及测定管。将其混匀之后，95℃水浴40min，取出后用流水冷却，然后4000转/分，离心10min，取上清，532nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。1.2.4谷胱甘肽过氧化物酶的测定参照测试盒说明书提供的方法将对照管与测定管进行酶促反应。混匀后，37℃水浴，预温5min，分别加入37℃预温的试剂一100μL。然后37℃水浴准确反应5min后分别再加入试剂二2000μL，对照管再加200μL的试剂盒样品。混匀后，4000转/分，离心10min，取上清1ml做显色反应。之后进行混匀，室温静置15min后，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。1.2.5计算公式（1）MDA含量活力的计算：组织MDA含量（nmol/mgprot）=（测定管OD值-标准空白管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）×标准品浓度（10nmol/mL）÷蛋白含量（mgprot/ml）血浆MDA含量（nmol/mgprot）=（测定管OD值-标准空白管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）×标准品浓度（10nmol/mL）×样品测试前稀释倍数（2）GPX活力的计算：组织GPX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（20umol/L）×稀释倍数（5*）÷反应时间÷（取样量×样本蛋白含量）血浆GPX活力=（