衍生化试剂在液相色谱中的应用

衍生化技术在液相色谱中的应用衍生化定义‡衍生化是色谱分析中常用的一种辅助手段。‡原理是待测样品与具有特定功能基团的衍生化试剂通过定量快速反应，生成符合分析要求的衍生化物，通过检测衍生化物的量来间接测定待测样品的量。衍生化目的‡改变待测物的色谱保留特性以改善分离度。‡改变待测物的检测特性，以增加其对检测器的响应（例：紫外标记、荧光标记、电化学标记）‡生成稳定的衍生化物，改善待测物的不稳定性（例：-SH基团易氧化的问题可通过酰化来解决）。衍生化反应的要求‡对反应条件要求不苛刻，且能迅速定量地进行。‡对目标物只生成一种衍生物，反应副产物（包括过量的衍生试剂）不应干扰目标物的分离与检测。‡化学衍生试剂方便易得，通用性好。HPLC化学衍生化分类在线化学衍生化★是否与HPLC系统联机离线化学衍生化柱前衍生化★发生衍生化发应的先后柱后衍生化柱前衍生‡定义：在色谱分离前，预先将样品制成适当的衍生物，然后再进入色谱柱进行分离检测。‡优点：（1）对用作流动相的溶剂体系没有限制；（2）反应条件，反应速率不受限制；（3）通过选择合适的试剂以及萃取方法，可以消除许多干扰；（4）转变成合适的衍生物，可使分离度改进。‡缺点：（1）操作过程繁琐，容易影响定量准确性；（2）当一个复杂组分样品经过衍生化反应后，有可能产生多种衍生化产物给色谱分离带来困难。柱后衍生‡定义：将样品先注入色谱柱，按选定的色谱条件使样品组分得以分离，当各个组分从色谱柱流出后，分别与衍生化试剂相遇，在一定的反应条件下，生成具有某种检测特性的衍生化产物再进入检测器。‡优点：（1）操作简便，可连续反应以实现自动化分析；（2）被分析物可以在其原有的形式下进行分离，容易选用已有的分析方法。‡缺点：（1）在色谱系统中反应，对流动相的选择更严格，必须考虑衍生化试剂、反应产物的溶解度，以及它们与流动相可能发生的副反应；反应速率必须很快（小于30s）；检测器对衍生化试剂不能有响应；（2）需要附加的仪器设备，如输液泵、混合室和加热器等，还会导致色谱峰展宽。柱后衍生流程图泵泵进进样样阀阀色色谱谱柱柱衍生化试剂泵衍生化试剂泵反应器反应器检检测测器器记记录录仪仪衍生化反应类别‡紫外衍生化‡荧光衍生化‡电化学衍生化‡手性衍生化紫外衍生反应‡在液相色谱法中，紫外吸收检测器是最常见的一种选择性、高灵敏度检测器。但很多化合物在紫外可见光谱区无吸收，无法检测。将它们与带有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下发生反应，由于反应产物带有发色基团而能被检测。‡能产生紫外吸收的物质应含有生色团：如C=C、C=O、N=N、NO2、C=S等基团，分子结构中如含有-OH、-NH2、-OR、-SH、-SR、-Cl、-Br、-I等助色基团时，当它们与生色团相连，能使该生色团的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加。•酰氯类衍生化试剂：如苯甲酰氯类•N‐琥珀酰亚胺对硝基苯乙酸酯（一）胺类化合物的衍生化•卤代烃衍生化试剂：如2,4‐二硝基氟苯（二）氨基酸的衍生化•异硫氰酸苯酯•茚三酮（三）羧酸的衍生化•含酰溴基的衍生试剂：如苯甲酰溴、对硝基苯甲酰溴、对氧基苯甲酰溴和对溴苯甲酰溴等（四）羟基的衍生化•酰氯类试剂：如3,5‐二硝基甲酰氯、对甲氧基苯甲酰氯等（五）羰基的衍生化•2,4‐二硝基苯肼•对硝基苄基羟胺荧光衍生化反应‡荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性的检测器，比紫外检测器的灵敏度要高10-1000倍，尤其适合痕量分析。OHMg1/2NCH3SO3NaCH3NH3CCH3OMg1/2荧光衍生化反应z荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性的检测器，比紫外检测器的灵敏度要高10‐1000倍，尤其适合痕量分析。z能产生荧光的物质分子结构：长共轭结构，如含有芳香环或杂环分子的刚性和共平面性SO3NaNSO3NaCH3NH3CCH3OHCH3荧光衍生试剂的基本构成发色团或荧光团（试剂分子母体）取代基反应基团胆磺酰肼DNS-H邻苯二甲醛OPA4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑NBD-Cl荧光素异硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC（一）（一）胺的衍生试剂分子式胺的衍生试剂分子式芳香邻二醛类芳香邻二醛类OPA、2，3-萘二醛（NDA）、3-（2-呋喃甲酰基）-喹啉-2-羰醛（FQCA）、3-（4-羧基苯甲酰基）-喹啉-2-羰醛（CBQCA）.CHOCONCOOHCHOCHOCHOCHOCHOCHORNH21RSH2NSR2R1++CHOCHOCN-RNH2NCNR++CHOCONCOOH-CNNCOOHCNNR++NH2R异硫氰酸酯类异硫氰酸酯类‡苯异硫氰酸酯（PITC）‡4-N，N-对二甲胺基偶氮苯-4ˊ-异硫氰酸酯（DABITC）‡4-（5，6-二甲氧基苯并噻唑）苯异硫氰酸酯‡荧光素异硫氰酸酯（FITC）COOHCHRNH2NCSNHCNHSCOOHRCHNNHCHOSPITCPTC-氨基酸PTH－氨基酸NNNNCS2()CH3NSCH3OCH3ONCS酰氯类酰氯类‡磺酰氯类（-SO2Cl）‡和羰酰氯（-COCl）SO2ClN()2CH3NSO2()CH32HNR2NR2R2HNOCH2R2NCOCH2OCOCl磺酰氯类磺酰氯类‡丹磺酰氯DNS-Cl‡p-4，4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）‡5，5-二丁氨基-1-萘磺酰氯（BNS-Cl）‡N-甲基-2-苯胺基萘-6-磺酰氯‡4-萘-1-偶氮-（4-二甲氨基苯）磺酰氯‡香豆素-6-磺酰氯（C-6-SO2Cl）羰酰氯‡9-芴甲氧基羰酰氯（FMOC-Cl）‡3，4-二氢-6，7-二甲氧基—4-甲基-3-喹恶啉-2-羰酰氯（DMMQC-Cl）‡6-甲氧基-2-甲基磺酰-喹啉-4-羰酰氯（MSQC-Cl）NNCH3OCH3OCH3OCOClNCH3OCOClSO2CH3CH2OCH2COClCH2COClOCH2活性卤类‡可与一、二级胺反应NNORXN-羟基琥珀酰亚胺活性酯类‡氨基甲酸酯类（AQC）和羧酸酯（SIIA）NOONOO2RNH2HO++COONCH2HOCONCH2NHROHCOONCH2NOOHOSIIA++NNHCOONOO2HOCO2NNHCONNHCONNH22RNHNOOHONOOHO+NHRAQC‡荧光素-O-乙酸酯（FL-O-Ac-SE)‡9-氰基-N，N，N，-三乙基-N-（5-琥珀酰亚胺氧羰基戊基）焦宁氯化物（PyroninSE）近红外的活性酯荧光衍生试剂NOOCOOHOOOCH2COO+(CH)252NCNOCH2CH3NOONOO‡琥珀酰亚胺-4，4二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸酯（BODIPY-C3-SE）‡琥珀酰亚胺-9-芴甲氧基甲酸酯（FMOC-SE）NOONNBFFCH3CH3CH2OCCH2ONOONHCOONOONCH2COONOONOOCH2COOCH2CONOO（二）（二）醇、酚的衍生试剂醇、酚的衍生试剂羰基氯类：FMOC,CEOC磺酰氯类:DNs-Cl卤代三嗪类:EDTN1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）（三）羰基化合物的衍生试剂（三）羰基化合物的衍生试剂肼类DNs-HCEOC-H氨基类氨基甲基芘（四）羧酸类化合物的衍生试剂溴甲基类BrMMC哌嗪基类DBD-Pz重氮甲烷基类ADAM其它类9-(2-羟乙基)-吖啶酮HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素(ADMC)(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃9-蒽重氮甲烷电化学衍生反应指样品与某些试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物，以便在电化学检测器上有较高的响应。环境介质对电化学反应有很大影响，如离子强度、pH值和溶剂组成等。常用的电化学衍生化试剂⑴还原衍生试剂最常用的还原衍生试剂是带硝基的芳香化合物。这些带硝基的衍生物能分别与羟基、氨基、羧基、羰基化合物反应生成具有电化学活性的衍生物。尽管这些衍生物都可用紫外检测器，但电化学检测的灵敏度高，选择性更好。常用的电化学衍生化试剂⑵氧化衍生试剂氧化衍生基团有芳氨基、酚羟基等。氧化衍生反应时，氧不干扰测定。许多紫外和荧光衍生试剂同样可用于电化学衍生。手性衍生化用手性试剂与外消旋体反应，在分子内导入另一手性中心，柱前衍生反应生成一对非对映异构体，两者间无镜相关系，物理化学性质不同，可用常规的色谱分离条件进行分离。手性衍生化选用该法分离通常基于以下原因：⑴不宜直接拆分，如游离胺类在手性固定相上往往呈颇弱的色谱性质，生成中性化合物则获得显著改善．⑵添加某些基团，以增加色谱系统的对映异构选择性．⑶提高紫外或荧光检测的效果．谢谢谢谢