医学检验实验指导

1《临床检验基础》实验指导（供医学检验专业五年制本科使用）遵义医学院医学检验系组编2005年12月2第一章外周血常规检验综合评价实验【检验流程】实验一红细胞计数【目的】掌握显微镜红细胞计数（redbloodcellcount）方法。【原理】用等渗稀释液将血液稀释一定的倍数，充入计数池后，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量。【器材】显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒。【试剂】红细胞稀释液（Hayem液）：氯化钠1.0g，结晶硫酸钠5.0g（或无水硫酸钠2.5g）蒸馏水加至200ml。溶解后加20g/l伊红溶液1滴，过滤后使用。【标本】外周血或抗凝血（EDTA抗凝）。【操作】熟悉检验方法及原理试剂配制及准备标本采集及处理白细胞计数及分类计数红细胞计数及血红蛋白测定血小板计数检验结果综合评价及临床意义探讨31．稀释液取小试管1支，加红细胞稀释液2ml。2．加血用清洁干燥微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，檫去管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清夜清洗吸管2~3次，立即混匀。3．充池混匀或用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放3~5min，待细胞下沉后于显微镜下计数。4．计数用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个方格内的红细胞数。5．计算红细胞/L=N×25/5×10×106×200=N×1010=N/100×1012N：表示5个方格内数得的红细胞数。25/5：将5个大方格内数得的红细胞数换算成1个大方格的红细胞数。×10：将1个大方格红细胞换算成1ul血液内红细胞。×106：1L＝106ul200：为血液的稀释倍数。【注意事项】1．采血时不能过分挤压采血部位，针刺部位深度必须适当。2．采血应顺利、准确，采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等。红细胞数量增高时可适当加大稀释倍数。3．大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则。避免多数或漏数。4．稀释液要过滤，小试管、计数板均须清洁干燥，以免杂质、微粒等被误认为是细胞。5．如无上述稀释液时，也可用新鲜配制的等渗盐水代替。6．将细胞悬液充入计数池时要一次完成，不能产生满溢、气泡、或充池不足的现象。7．红细胞在计数池中若分布不均，每个方格之间相差超过20个以上时要重新充池计数。正常数值范围内，2次红细胞计数相差不得超过5%。【方法学评价】目视计数法是传统的的红细胞计数法，不需要特殊设备，但操作复杂、费时。【质量控制】41．计数评价在细胞计数的评价中，多采用两差比值（r）评价。2．稀释造成稀释倍数不准确的常见原因有：①稀释液或血液加样不准确。②吸血时吸管内有气泡。③未檫去吸管外血。④血液加入稀释液时使上清液浑浊，血液被吸管带出。⑤稀释液放置的时间过长，蒸发浓缩。【参考值】①成年男性：（4.0～5.5）×1012／Ｌ。②成年女性：（3.5～5.0）×1012／Ｌ。③新生儿：（6.0～7.0）×1012／Ｌ。实验二血红蛋白测定氰花高铁血红蛋白测定法【目的】掌握氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定方法。【原理】在血红蛋白转化液中，除硫化血红蛋白外，其余血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与氰离子（CN-）结合，生成稳定的复合物氰化高铁血红蛋白（hemoglobincyanide，HiCN）。棕红色的氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有吸收峰，可用校正的高精密分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN参考液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。【器材】一次性消毒采血针，微量吸管，试管。5ml移液管，75%（V/V）乙醇棉球，无菌干棉球，分光光度计，试管。【试剂】1．HiCN转化液（文齐液）氰化钾（KCN）50mg，高铁氰化钾[K3Fe（CN）6]200mg，无水磷酸二氢钾（KH2PO4）140mg，TritonX–1001.0ml，蒸馏水加至1000ml，纠正pH至7.0~7.4。此液淡黄色透明溶液，用蒸馏水调零，比色杯径1.000cm，波长540nm处的吸光度应0.001。贮存在棕色有塞玻璃瓶中，放4℃冰箱保存，一般可保存数月。如发现试剂变绿、浑浊不能使用。2．HiCN标准液（200g/L）商品试剂。【标本】外周血。5【操作】1．直接定量测定（1）加转化液：试管内加5mlHiCN转化液。（2）采血与转化：取全血20ul，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。（3）测定：以符合WHO标准的分光光度计（常规测定时带宽应小于6cm）。波长540nm处，光径（比色杯内径）1.000cm，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度（A）。（4）计算：根据标本的吸光度（A）直接计算出血红蛋白浓度（g/L）。血红蛋白（g/L）=A×64458/44000×251+A×367.7A：540nm处测定管吸光度。64458：目前国际公认的血红蛋白平均相对分子量。44000：1965年国际血液学标准化委员会（ICSH）公认的血红蛋白摩尔消光系数。251：稀释倍数。2．HiCN标准液比色法测定（1）标准曲线绘制和K值计算。用HiCN标准液倍比稀释后（50g/L、100g/L、150g/L、200g/L），在所用的分光光度计上（相当540nm处）分别测定各稀释度的吸光度，以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或求出此换算常数K。（2）标本的血红蛋白转化和比色同直接测定，得到标本的吸光度（A）。（3）通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用K值来计算血红蛋白浓度，即Hb（g/L）=K×A例，如倍比稀释后HiCN标准液50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，分别测得540nm处的吸光度为0.13、0.27、0.41、0.54，标本的吸光度为0.32。先求K值，再计算出标本的血红蛋白浓度（g/L）。K=ΣHb/ΣA=50+100+150+200/0.13+0.27+0.41+0.54=370.37Hb=370.37×0.32=118.52（g/L）【注意事项】61．血红蛋白测定方法很多。但无论采用何种方法，都必须以HiCN法为标准，绘制标准曲线。标准曲线或K值应定期检查，并与分光光度计相配。2．标准微量吸管必须经过水银称重法校正。加液必须准确，血液与转化液充分混匀。可用血红蛋白代替抗凝血进行鉴定。3．HiCN转化液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测定结果偏低。HiCN转化液应贮存在棕色他塞是玻璃瓶中，4℃冰箱保存一般可用数月，但不能在0℃以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使转化液褪色失效。HiCN转化液是一种低离子强度而pH又近中性的溶液，遇到白细胞过多或异常球蛋白增高的血液标本，HiCN比色液会出现浑浊。若因白细胞过多引起的浑浊，可离心后去上清液比色；若因球蛋白异常增高（如肝硬化者）引起的浑浊，可向比色液中加如少许固体氯化钠或碳酸钾，混匀后可使溶液澄清。氰化钾是剧毒品，配置转化液时要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN转化液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在。毒性不是很大。若进入人体宁日，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CN-，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢算气体。为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中。按没升HiCN废液加次氯酸钠溶液（安替福民）40ml，充分振摇混匀，敞开容器，置室温3h。【方法学评价】HiCN法操作简便，试剂单一，除SHb外所有血红蛋白均可迅速转化为HiCN，显色快且稳定（显色后若保存得当可达6年不褪色），可以根据吸光度直接计算结果，因此被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法，但其试剂中氰化钾为剧毒药品，须妥善保存，处理。另外，高铁蛋白血症和白细胞明显增高的标本可导致反应液浑浊而影响结果。【质量控制】若用分光光度计作精密定量测定，分光光度计的波长和吸光度需要校正，带宽应小于1nm，比色杯光径1.000cm，允许误差为0.5%（即0.995~1.005），测定温度为20~25℃。仪器的校正是测定中的关键。校正大致分为以下几个步骤。1．波长将100~150g/L的HiCN标准液放在待检分光光度计中，从500~600nm分几个波段测定HiCN标准液的吸光度，如所测最大吸收凤在540nm，表示7分光光度计波长准确；实际工作中对波长偏差不大的分光光度计可把吸收峰波长（如在536nm）当作540nm进行测定。2．HiCN吸收光谱峰值在540nm，峰谷在504nm。杂光的增加使HiCN在吸收峰处吸光度下降，而对峰谷处吸光度影响不大。设Q值为反映杂光水平的参数，Q=A540/A504，合格的分光光度计Q值应为1.59~1.63。杂光可使吸收光谱的Q值减低。3．比色杯用HiCN试剂作空白，波长710~800nm，比色杯光径1.000时，吸光度应小于0.002。4．敏度和线性用HiCN标准液倍比稀释（应包括高，低病理浓度）后，在数用的分光光度计上相当540nm分别测定各稀释度的吸光度，以标准液血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制曲线。观察各点连线是否为直线，如有个别点不在直线上，作图时应使直线通过尽量多的点。也可用直线回归法计算回归曲线（y=bx+a）后作图。将直线以外的实测吸光度与直线上理论吸光度比较，如两者之差在5%以内则可认为仪器符合线性的要求。直线的最低点即为该仪器HiCN法的灵敏度；最低与最高点间的范围即为仪器HiCN法的测定线性范围。此外，引起测定值增高的常见误差是稀释倍数不准确，因红细胞溶解不当引起标本浊度增加，血浆中脂质或蛋白量增加。【参考值】①成年男性：120~160g/L；成年女性：110~150g/L。②70岁以上老年男性：94.2~122.2g/L；女性：86.5~111.8g/L。③新生儿：170~200g/L。实验三白细胞计数【目的】掌握显微镜法白细胞计数的原理及方法。【原理】用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。8【器材】显微镜、改良Neubauer计数板、试管、吸管、微量吸管、滴棒。【试剂】白细胞稀释液：2%冰乙酸溶液中加入10g/l结晶紫（或亚甲蓝）3滴。【标本】新鲜全血或末梢血。【操作】1．加稀释液哟拗不过吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。2．吸取血液用微量吸管吸取新鲜全血或末梢血20ul，查去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管2~3次。3．混匀将试管中血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。4．充池再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入改良Neubauer计数池中，室温静置2~3min，待白细胞完全下沉。5．计数在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。6．计算白细胞=4个大方格内白细胞数（N）×10×20×106/4=N/20×109/L【注意事项】1．吸管、微量吸血管、血细胞计数板均为计量工具，使用前需经过严格的校正，否则将直接影响计数结果的准确。2．是用标本可为由静脉穿刺采取的新鲜全血，也可为静脉末梢血。采集末梢血时，应注意采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等，以免标本失去代表性；同时也注意不能过度挤压，以免组织液混入引起血液凝固或造成计数结果不准确。3．在充池时，如充液不足、液体外溢、断续充液，或产生气泡、充液后移动盖玻片等，均会使细胞分布不均匀，造成计数结果不准确。4．计数池内的细胞分布应均匀，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%。若相差太大应重新充池。5．计数大小方格内的压线细胞时，应遵循数上不数下，数左不数右的原则。6．白细胞数量过多时，可采用加大稀释倍数的方法。如20ul血加入到0.78ml稀释液中或10ul血加到0.38ml稀释液中。97．白细胞数量过少时，可采用扩大计数域的方法，计数8个或9个