喷雾干燥法制备神经毒素壳聚糖鼻腔给药微球的研究

1喷雾干燥法制备神经毒素壳聚糖鼻腔给药微球的研究蔡鑫君，夏爱晓，柴国宝，魏颖慧，冯健，李范珠(浙江中医药大学药学院，浙江杭州310053)摘要：目的制备神经毒素壳聚糖微球，并对其体外释药模式进行研究。方法采用喷雾干燥法制备神经毒素壳聚糖微球，以包封产率为指标，考察了处方与工艺因素对壳聚糖微球的影响，并采用正交设计L9(3)4对处方和工艺进行了优化。结果最优处方为壳聚糖浓度为0.75％，壳聚糖-TPP重量比为10∶1，进口温度105℃，空气流速550L/h。优化处方制备的神经毒素壳聚糖微球表面圆整，载药量为(19.23±0.42)％，包封产率为(92.10±2.1)％，平均粒径为(6.86±0.76)μm。体外释药数据用Higuchi模型拟合得方程Q=11.42t1/2-5.89(r=0.9920)，表明该微球具有缓释作用。结论采用喷雾干燥法制备微球，具有工艺稳定、可连续操作等优点，制备的神经毒素壳聚糖微球具有较好的缓释特性，关键词：喷雾干燥法；神经毒素；壳聚糖微球；体外释放PreparationofChitosanMicrospheresLoadedwithNeurotoxin-ⅠforNasalDeliverybySprayDryingTechniqueCAIXin-jun,XIAAi-xiao,CHAIGuo-bao,WEIYing-hui,FenJian,LIFan-zhu*(CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053)ABSTRACT:OBJECTIVETopreparethepreparationofneurotoxin-Ⅰloadedchitosanmicrospheresandtoinvestigatethedrugreleasebehaviorinvitro.MethodsMicrosphereswerepreparedusingthespraydryingmethod，theencapsulationefficiencywasusedtoevaluatetheinfluenceofdifferentformulationandpreparationfactors，theformulationwasoptimizedbyorthogonaldesignL9(3)4.ResultsTheoptimalformulationwasasfollows：chitosanconcentration(0.75%)，ratioofchitosantoTPP(10：1)，inlettemperature(105℃)，airflowrate(550L/h).Theoptimizedmicrosphereshadasphericalshape，thedrugloadingwas(19.23±0.42)%，encapsulationefficiencywas(92.10±2.1)%，averagediameterwas(6.86±0.76)μm.ThedrugreleaseprofileinvitrocouldbedescribedbyHiguchiequationQ=11.42t1/2-5.89(r=0.9920)，theresultsshowedthemicrospherespreparedobviouslysustained基金项目：国家自然科学基金资助项目（30371781），国家自然科学基金资助项目(30772793)，第一作者简介：蔡鑫君（1985-），男，硕士研究生，主要研究方向为中药新剂型。Tel:[phone]E-mail:[e-mail]通讯作者：李范珠，男，教授，博士生导师研究方向：药物新技术与新剂型研究。Tel:[phone]E-mail:[e-mail]2releaseeffect..ConclusionPreparationofsustained-releasemicrocapsulebyspraydryingisasimplemethod，theprocessisstable.KeyWord:spraydryingtechnique;neurotoxin-Ⅰ;chitosanmicrospheres;invitrorelease神经毒素(neurotoxin-Ⅰ，NT-Ⅰ)是从云南眼镜蛇毒液中分离得到的一类短链神经毒素的主要成分之一，具有中枢镇痛作用，无耐受性和依赖性，安全性高，主要以肌注方式用于控制各种疼痛及戒毒，起效较慢(约3～5h)，难以满足临床需求[1]。鼻腔给药是目前研究较多的适合多肽蛋白质类药物的新型给药系统，药物吸收迅速，可避免肝首过作用、消化道黏膜的代谢和降解，给药方便，患者依从性好。研究表明，鼻腔给药对相对分子质量(Mr)小于1000的脂溶性药物吸收较好[2,3]。由于NT-Ⅰ的Mr较大(6700)，易溶于水，直接鼻腔给药吸收有限[4]。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物黏附性，同时能促进蛋白质等大分子药物透过黏膜，因此在鼻腔微粒给药系统中的应用日益增多[5]。喷雾干燥法制备微球具有一次成球、干燥时间短、易实现扩大生产等优点，尤其适于蛋白质等热敏性药物的微囊化[6]。为提高NT-Ⅰ鼻腔给药的生物利用度，本研究以生物降解型高分子材料壳聚糖为载体，以三聚磷酸钠(sodiumtripolyphosphate，TPP)为交联剂，采用喷雾干燥法制备NT-Ⅰ微球，用正交设计优化处方，并考察其体外释放行为。1仪器与试药290型喷雾干燥机(瑞士Büchi公司)；UV-1700型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；XL30ESEM型扫描电子显微镜(Phlips公司)；Winner2000Z型智能全自动台式激光粒度分析仪(济南微纳仪器有限公司)。NT-Ⅰ原药(中国科学院昆明动物研究所，纯度＞99％，批号060530)；壳聚糖(上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度≥85％，黏度＜0.1Pa·s，批号050106)；试剂Ⅰ[自制，4％NaCO3溶液与0.2mol/L氢氧化钠溶液的等体积混合液和1％CuSO4溶液与2％酒石酸钾钠溶液的等体积混合液按50∶1(v/v)混匀，临用前配制]；Folin试剂(上海喜润化学工业有限公司)；透析袋(截留分子量为15000，上海绿鸟科技发展有限公司)；其它试剂均为分析纯。2方法与结果2.1NT-Ⅰ-壳聚糖微球的制备[7]用喷雾干燥法制备NT-Ⅰ-壳聚糖微球。精密称取壳聚糖适量，用1％乙酸溶解后配成不同浓度备用。NT-Ⅰ与壳聚糖按4∶1(w/w)混合，搅匀，再按不同重量比将1％TPP溶液缓3慢滴入壳聚糖溶液，1000r/min搅拌固化30min，静置待无气泡时即可，分别在不同进口温度、不同空气流速下进行喷雾干燥得到微球粉末。同法制备不含NT-Ⅰ的空白微球。2.2微球载药量和包封产率的测定2.2.1分析方法取空白微球100mg和NT-Ⅰ水溶液(103.2g/mll)适量，置同一烧杯中，精密加入3％柠檬酸钠溶液50ml，室温下搅拌(300r/min)24h使微球溶解，离心(10625×g)10min，取上清液1ml，用蒸馏水定容至5ml，用Lowry法[8,9]在650nm处测定吸光度(D)。另取未加入NT-Ⅰ溶液的空白微球100mg同法操作。结果表明，空白微球在650nm处无吸收，对NT-Ⅰ含量的检测无干扰。2.2.2标准曲线精密称取NT-Ⅰ适量，加水溶解并稀释成2.58mg/ml的贮备液。精密吸取贮备液适量，用水稀释成浓度为25.8、51.6、103.2、154.8、206.4、258g/ml标准溶液。分别精密吸取1ml，各置试管中，加入试剂Ⅰ5ml，涡旋混匀，于30℃保温10min，再加入Folin试剂0.5ml，涡旋混匀后继续保温30min。另取蒸馏水2ml，试剂Ⅰ和Folin试剂的用量为10ml和1ml，其它操作同上，作为空白对照，于650nm处测定D。以D对NT-Ⅰ浓度(c)线性回归，得标准曲线方程D=0.0022c+0.0102，r=0.9995，表明NT-Ⅰ在浓度为25.8～258μg/ml内线性关系良好。2.2.3精密度试验分别精密量取250、125、62.5g/ml的NT-Ⅰ溶液，各5份，按“2.2.2”项下方法测定，计算得高、中、低浓度的日内RSD分别为0.29％、0.25％、0.94％；连续5d测定，计算得日间RSD分别为0.45％、0.62％、0.86％。2.2.4回收率试验精密称取空白微球100mg，分别加入250、125、62.5g/ml的NT-Ⅰ溶液，各5份，按“2.2.2”项下方法测定，计算得高、中、低浓度的方法平均回收率分别为98.5％、100.1％、99.0％，RSD分别为1.02％、1.87％、1.25％。2.2.5载药量和包封产率的测定精密称取含药微球约100mg，置锥形瓶中，按“2.2.2”项下方法操作测定，由标准曲线计算NT-Ⅰ含量，计算载药量与包封产率(包封产率=微球实际载药量/微球理论载药量×100％)[10,11]。2.3正交设计优化处方和工艺4在预试验基础上采用正交设计考察影响微球包封产率的4个因素：壳聚糖浓度(A)、壳聚糖与TPP的重量比(B)、进口温度(C)、空气流速(D)，各取3水平(见表1)。按L9(34)表安排试验，以包封产率为考察指标，优选最佳处方工艺，重复实验3次，考察微球制备工艺的重现性。正交实验因素水平表见表1。表1因素和水平Table1Factorsandlevels水平因素A/w·v-1B/w·w-1C/℃D/L·h-110.2510：110045020.5015：110550030.7520：1110550表2正交试验结果Table2CalculationandanalysisoforthogonaltestNOABCD包封产率∕%1111181.352122280.453133379.054212388.075223180.856231285.357313287.108321387.409332187.15均值Ⅰ80.28385.50784.70083.117均值Ⅱ84.75782.90085.22384.300均值Ⅲ87.21783.85082.33384.840极差6.9342.6072.8901.723结果表明，各因素对包封产率的影响依次为A＞C＞B＞D，最佳组合为A3B1C2D3，即5壳聚糖浓度为0.75％，壳聚糖-TPP重量比为10∶1，进口温度105℃，空气流速550L/h。2.4优化处方工艺验证按优化处方制备3批NT-Ⅰ-壳聚糖微球，载药量和包封产率为(19.23±0.42)％、(92.10±2.1)％，表明处方工艺重现性较好。2.4.1微球的形态及粒径分布取适量微球用扫描电镜观察，结果表明微球外形圆整，大小均匀(图1)。将制得的NT-Ⅰ-壳聚糖微球混悬于无水乙醇中，用激光粒度仪测得微球粒径平均粒径为(6.86±0.76)m(n=3)。图1NT-Ⅰ微球的扫描电镜照片(A：×1000，B：×4000)Fig.1PatternofNT-ⅠmicrospheresbySEM(A：×1000，B：×4000)2.4.2体外释放实验采用恒温振荡法。精密称取NT-Ⅰ或NT-Ⅰ-壳聚糖微球适量，装入透析袋内，扎紧后置磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，(37±0.5)℃振荡(速率100r/min)。分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、48、72、96h取样1ml(同时补加等量同温介质)，用Lowry法测定样品中NT-Ⅰ含量，计算累积释放率(Q)，结果见图2。010203040506070809010001224364860728496108120t/h累积释放率/%◆—NT-Ⅰ原药；■—NT-Ⅰ-壳聚糖微球图2体外释放曲线(n=3)◆—NT-Ⅰ；■—NT-Ⅰchitosan