嗜盐菌的分离与生理活性测定

嗜盐菌的分离与生理活性测定嗜盐菌的分离与生理活性测定张兆轩生命科学学院生物科学07级2007300111组员：陈晓文廖永杰指导教师:韩庆国老师【摘要】本实验为基础性创新性实验，以加强学生自主创新为目的，锻炼学生实验操作能力，分离筛选含有蛋白酶活性的细菌。嗜盐菌作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，近年来受到人们的广泛关注。但是，目前对嗜盐微生物的分离还远远不够。因此，分离更多的未知嗜盐菌，包括极端嗜盐古菌和中度嗜盐菌是微生物资源开发的必要前提和关键之一。在我国存在很多高盐环境，如新疆、内蒙、青海、山东和甘肃都有大面积的盐碱化土壤和许多盐湖。这些为我们开展嗜盐微生物的分离和系统分类提供了得天独厚的条件。我们从深圳东角头地区的高盐环境采集到样品，进行嗜盐菌的多种生物学研究。【关键词】嗜盐菌蛋白酶活性最适盐浓度最适温度【前言】嗜盐菌,又称作副溶血性弧菌。海水是它的乐园,盐腌的食品又是它栖居之地。海鱼、海蟹、海贝等海产品，以及不太咸的咸菜、咸蛋、腌鱼、腌肉之类一旦沾上嗜盐菌就会大量繁殖，速度十分惊人。实验表明，该菌最喜欢含盐量2%—4%的环境，在5%—6%的高盐浓度或营养丰富的低盐浓度都会孽生。尤其是温度适宜的夏季，10个嗜盐菌在3—4小时后就会育出数百万个后代。这是一个可怕的天文数字，但人的肉眼和其他感觉器官难以察觉。嗜盐菌是科学家们在死海中发现的极细小微生物。科学家们研究嗜盐菌，发现嗜盐菌似乎是修复DNA损伤的高手，研究人员用辐射轰击法破坏嗜盐菌的DNA细胞，使其分裂成碎片，但几个小时后，嗜盐菌又将染色体重新“召集”在一起。再次恢复正常功能。科学家们看中嗜盐菌的DNA修复能力，对嗜盐菌进行深入研究，使科学家们探知了更多有关生物技术和癌症的秘密，科学家们还认为嗜盐菌有助于研究和解决：如何让宇航员在太空旅行中，免受宇宙射线伤害的问题。1实验器材及材料1.1实验材料深圳东角头海泥1.2实验用品1.2.1富集培养基的配制（g/L)蛋白胨7.5；NaCl150；酵母浸膏10；MgSO4·7H2O10；柠檬酸钠3；KCl2；FeSO4·7H2O0.05；pH7.0。固体培养基：加入2%琼脂1.2.2基本培养基（g/L）葡萄糖20；胰蛋白胨1；酵母提取粉1；硫酸镁0.5；NaCl5；磷酸氢二钾6；磷酸二氢钾3；硫酸铵1；1.2.3营养肉汤培养基（g/L）嗜盐菌的分离与生理活性测定营养肉汤36g，固体培养基加入2%琼脂1.3实验仪器恒温培养箱、无菌操作台、恒温摇床、冰箱、分光光度计、高压灭菌锅、移液枪，离心机、水浴锅2实验步骤2.1培养基配制①一组2－3人，每组200ml，共配1000ml。②灭菌完毕后，将培养基拿出，冷却。取海泥3g，加入富集培养基中，摇匀。37℃下振荡培养3天。2.2划线分离①富集培养基加琼脂2%，配制橙固体培养基，灭菌后倒平板。②取富集培养的菌液划线分离。③按单菌落到估计培养基，长满平板。2.3抗细菌活性的筛选①金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活化培养，培养基用肉汤培养基。注意：连续活化两次，第二次要在做抑菌实验前18小时培养。活化16－18小时的菌取1ml到50℃固体肉汤培养基中摇匀后，倒平板。打洞取嗜盐菌琼脂块于平板上，24小时看结果。②取上一步骤的具有透明圈的菌种2~3环至基本培养基中，振荡培养3天。将已活化的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别取2ml到50℃固体肉汤培养基中摇匀后，倒平板后迅速用胶塞打洞，并在培养基凝固前取出胶塞。把培养3天的菌液取部分到离心管，1w/r30min离心，离心后取上清液200µl，注入上述培养基的洞中，37℃恒温培养箱，24小时后观察有无透明圈。2.4具有蛋白酶活性的筛选①牛奶平板：配浓度为3％的脱脂奶粉溶液，单独灭菌（110度，30min)，铺平板前再与加热熔化的肉汤蛋白胨培养基混合。乘热在2倍肉汤蛋白胨固体培养基中添加同体积的牛奶溶液。②涂点接种。③1-2天后观测透明圈并拍照。2.5耐盐度的测定配制富集液体培养基，NaCl浓度分别为1%、5%、10%、15%、20%和25%。接种2-3环菌液至盐浓度为1%的富集培养基中，振荡培养1天。取培养了1天的1%的菌液1mL，分别加至5%-25%盐浓度的液体培养基中，振荡培养1天后，用分光光度计测定吸光值（600nm）。2.6最适温度的测定上述NaCl浓度为5%的菌液预先活化，各取活化后菌液1ml至6瓶富集液体培养基中，分别在35℃、45℃、50℃、55℃和60℃振荡培养1天后（另设一组对照组不加盐、不加菌液），用分光光度计测定吸光值（600nm）嗜盐菌的分离与生理活性测定3实验结果①出现单一菌落2个；②所有菌均无透明圈；③最适盐浓度为10%，OD值见表1；表1不同盐浓度下的OD值盐浓度1%5%10%15%20%25%OD值01.4871.5041.2031.1981.267盐浓度与OD值的曲线关系④最适温度为35℃，OD值见表2；表2不同温度下的OD值温度35℃40℃45℃50℃55℃60℃OD值1.4851.2270.6240.3120.1900.187温度与0D值的曲线关系嗜盐菌的分离与生理活性测定4讨论分析(1)嗜盐菌是生活在高盐环境中的细菌，多生长与盐湖、盐碱湖、死海、盐场和海洋中。其生长最适浓度高达15%-20%。海水中的主要阳离子有Na+、K+、Mg2+。阴离子有Cl-、SO42-、HCO3-等。(2)由于取材为海边海泥，菌落的耐盐性教普通细菌高，达到了10%，是否有更高的抗盐性细菌有待进一步筛选。(3)筛选出的菌落最适温度为30度，比普通的细菌37°C低，原因可能与其长期生长的环境有关，但是在更低温的环境下能否更好存活有待进一步考证。(4)培养过程中使用摇床的意义在于增加水中的溶氧量，有助于细菌的生长，同时防止菌体在摇瓶底部沉积，使培养过程更加迅速。(5)筛选菌时，应尽量筛选有极端特征的菌落，例如：极度嗜盐菌，耐高温嗜盐菌等。这样的菌落在日常运用与科学价值方面都要远远高于其他菌落。(6)菌群的生长一般需要两天，培养18小时后菌落处于对数生长期，对外界环境的敏感度也最强，是最适合进行实验的时候。(7)高抗性嗜盐菌在生产生活中有一定的应用，可用于高盐废水处理和细菌抗性方面的研究。(8)嗜盐菌，特别是极端嗜盐菌，对高盐环境有很好的适应性。在嗜盐菌的细胞内具有相当高的离子浓度，基本上与细胞外的离子浓度相等。这样可以抵抗胞外高盐溶液对细胞的脱水作用。另外，嗜盐菌具有浓缩K+和排斥Na+的能力，显示对环境中离子的选择作用，在细胞内K+比Na+浓度大得多，于是在Na+占优势的高盐环境中，也不会又过多的Na+进入细胞。而且在嗜盐菌的生理活性中，K+比Na+更具有活化作用。(9)嗜盐菌是极端环境生物的重要类群之一，作为重要的盐田生物，更作为一种新型微生物资源，它不仅为微生物生理、遗传和分类及生命科学和相关学科许多领域的研究提供新的课题，也为生物进化、生命起源的研究提供新的材料，展现了它潜在而广阔的应用前景。参考文献[1].株中度嗜盐菌的分离及生理生化特性研究-安徽农业科学2008,36(4)[2].学位论文一株中度嗜盐菌的分离、鉴定及系统发育分析2009[3].学位论文嗜盐菌的分离及其多相分类学研究2007[4].期刊论文从污泥中分离到一株降解苯乙酸的中度嗜盐菌(BYS-1)-南京农业大学学报2003,26(2)[5].期刊论文两株中度嗜盐菌的分离与生理生化分析-兰州大学学报(自然科学版)2003,39(4)[6].期刊论文新疆地区盐湖的中度嗜盐菌的数值分类-微生物学通报2002,29(3)