四大类微生物菌落形态的比较和识别

四大类微生物菌落形态的比较和识别一、实验目的和内容目的：1熟悉四大类微生物菌落的主要特征2掌握识别四大类微生物菌落形态的依据和要点，并应用于识别未知菌落内容：1观察已知的四大类微生物菌落特征2辨认未知的四大类微生物菌落特征实验原理掌握识别四大类微生物菌落形态的要点对于从事菌种的筛选、杂菌的识别和菌种鉴定等项工作都有重要意义。菌落是由某一微生物的少数细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后所形成的子细胞群体，因此，菌落形态在一定程度上是个体细胞形态和结构在宏观上的反映。由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也各异。在四大类微生物的菌落中，细菌和酵母菌的形态较接近，放线菌和霉菌形态较相似。菌和酵母菌的异同细菌和多数酵母菌都是单细胞微生物。菌落中各细胞间都充满毛细管水、养料和某些代谢产物，因此，细菌和酵母菌的菌落形态具有尖似的特征，如湿润、较光滑、较透明、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致，且菌落质地较均匀等。它们之间的区别如下：细菌：由于细胞小，故形成的菌落也较小，较薄、较透明且有“细腻”感。不同的细菌会产生不同的色素，因此常会出现五颜六色的菌落。此外，有些细菌具有特殊的细胞结构，因此，在菌落形态上也有所反映，如无鞭毛不能运动的细菌其菌落外形较圆而凸起；有鞭毛能运动的细菌其菌落往往大而扁平，周缘不整齐，而运动能力特强的细菌则出现更大、更扁平的菌落，其边缘从不规则、缺刻状直至出现迁居性的菌落，例如变形杆菌属和菌种。具有荚膜的细菌其菌落更粘稠、光滑、透明。荚膜较厚的细菌其菌落甚至呈透明的水珠状。有芽孢的细菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皱褶等特征。细菌还常因分解含氮有机物而产生臭味，这也有助于菌落的识别。酵母菌：由于细胞较大（直径约比细菌大10倍）且不能运动，故其菌落一般比细菌大、厚而且透明度较差。酵母菌产生色素较为单一，通常呈矿蜡色，少数为橙红色，个别是黑色。但也有例外，如假丝酵母因形成籍节状的假菌丝，故细胞易向外圈蔓延，造成菌落大而扁平和边缘不整齐等特有形态。酵母菌因普遍能发酵含碳有机物而产生醇类，故其菌落常伴有酒香味。2．放线菌和霉菌的异同放线菌和霉菌的细胞都是丝状的，当生长于固体培养基上时有营养菌丝（或基内菌丝）和气生菌丝的分化。气生菌丝向空间生长，菌丝之间无毛细管水，因此菌落外观呈干燥、不透明的丝状、绒毛状或皮革状等特征。由于营养菌丝伸入培养基中使菌落和培养基连接紧密，故菌丝不易被挑起。由于气生菌丝、孢子和营养菌丝颜色不同，常使菌落正反面呈不同颜色。丝状菌是以菌丝顶端延长的方式进行生长的，越近菌落中心的气生菌丝其生理年龄越大，也越早分化出子实器官或分生孢子，从而反映在菌落颜色上的变化，一般情况下，菌落中心的颜色常比边缘深。有些菌的气生菌丝还会分泌出水溶性色素并扩散到培养基中而使培养基变色。有些菌的气生菌丝在生长后期还会分泌滴，因此，在菌落上出现“水珠”。放线菌：放线菌属原核生物，其菌丝纤细，生长较慢，气生菌丝生长后期逐渐分化出孢子丝，形成大量的孢子，因此菌落较小，表面呈紧密的绒状或粉状等特征。由于菌丝伸入培养基中常使菌落边缘的培养基呈凹状。不少放线菌还产生特殊的土腥味或冰片味。霉菌：霉菌属真核生物，它们的菌丝一般较放线菌粗（几倍）且长（几倍至几十倍），其生长速度比放线菌快，故菌落大而疏松或大而紧密。由于气生菌丝会形成一定形状、构造和色泽的子实器官，所以菌落表面往往有肉眼可见的构造和颜色。根据上述特征可将四大类微生物菌落的识别要点归纳如下：三、实验材料和用具已知菌落：细菌类（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌）酵母（酿酒酵母）放线菌类（细黄链霉菌）霉菌类（产黄青霉、黑曲霉、黑根霉）未知菌落试剂：培养基（牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基和高氏1号培养基）四、操作步骤1制备已知菌的单菌落通过平板划线法获得细菌、酵母菌和放线菌的单菌落。用三点接种法获得霉菌的单菌落。细菌平板放37恒温培养24~48小时。酵母菌平板置28培养2~3天。霉菌和放线菌置28培养5~7天。待长成菌落后，观察并记录四大类微生物菌落的形态特征。2制备未知菌的菌落特征从环境检测所获得的平板，挑取若干个菌落，逐个编号，作为识别四大类用的未知菌落。3辨别未知菌落1.区分“干”或“湿”：根据菌落是“干”或“湿”及菌落正反面颜色、中央与边缘颜色是否一致，首先判断某未知菌落是属于细菌、酵母菌类，还是属于放线菌、霉菌类。2.细分菌落：根据上述要点进一步区分未知菌落是属于四大类中的哪一类菌，并将判断结果填入下表中。3.结果记录（一）菌落形态特征的描述1．细菌菌落的描述菌落表面形态：有光滑、皱褶、放射状、根状等菌落边缘形态：有整齐、波状、丝状、锯齿状、裂叶状等形态菌落隆起形态：有扁平、隆起、草帽状、胶状等透明度：可分为秀明、半透明、不透明等2．酵母菌菌落形态的描述：可参照细菌3．放线菌和霉菌菌落的描述：菌落表面的形态：粗糙、同心圆、辐射状沟纹、粉状、绒毛状或皮革状等。菌落颜色：菌落正面颜色（包括气生菌丝或孢子颜色）；菌落反面颜色（指营养菌丝颜色）；有否水溶性色素？（色素会渗入培养基中，使菌落周围的培养基改变颜色）。（二）将已知菌落形态的观察和描述记录于表1中（三）将对未知菌落的辨别结果记录在表2中六、注意事项1每张实验台上各有一套已知菌落和未知菌落，观察时请勿随意搬动，以免搞混菌号。2观察和判断菌落大小时，要注意单菌落在平板上分布疏密的情况，一般菌落密集处勤菌落小，分布稀少的部位菌落大。表1已知菌落形态的观察记录辨别要点菌落描述表2未知菌落的观察记录菌落号湿干菌落描述判断结果厚或薄大或小松或密大或小表面边缘隆起形状颜色透明度正面反面水溶性色素大类菌名湿干表面边缘隆起形状颜色透明度厚薄大小松密大小正面反面水溶性色素细菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌酵母菌酵酒酵母粘红酵母热带假丝酵母放线菌细黄链霉菌霉菌青霉曲霉根霉┊┊┊┊┊分离的基本方法微生物分离的方法很多，主要有连续稀释分离法，平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中，单细胞分离法需要贵重精密仪器，中学无法开展，而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行，中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。1.连续稀释分离法①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。2.平板划线分离法①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。二、各类微生物的分离1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌其分离方法见本节“分离的基本方法”2.从土壤中分离放线菌①制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。②称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。振荡10分钟，制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱中，培养7～10天，培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。④挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。3.从土壤中分离霉菌①制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。将培养皿中，凝成平板，待用。②称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱内培养3～4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。4.从饮水中分离大肠杆菌①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。一、平板划线分离法由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。二、稀释倒平板法先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000…），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。稀释涂布法：优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培养基的回收率计数！！稀释混合平板法：优点：可以计数，吸收量为1ml，较方便。优点：不能观察菌落特征。一般用于菌落总数的计数！！平板划线法：优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离！！缺点：不能计数一般用于从菌种的分纯！涂布法使用较多，但有时不均匀稀释倒平板法操作相对麻烦，不适合好氧和对热敏感的细菌培养应用范围：涂布法适用于好氧菌稀释倒平板法适用于厌氧，兼性厌氧菌种的分离取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C恒温下培养48h。挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜检，茵体一致)。结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。再分别转移到