中国农业大学学报

中国农业大学学报!!#!$%%#$DA&’!()*+,-.)/012,-34+25*.6*+-.7,289+:26;含氮杂环化合物对四膜虫的毒性作用研究徐忠东$!施荣华!!耿明$!陶瑞松$$J合肥师范学院生物系!合肥!%’$%!J中国科学技术大学生命科学学院!合肥!%’$#收稿日期$!#&$&$$基金项目$安徽省教育厅自然基金资助项目!’e($?W#作者简介$徐忠东!副教授!主要从事原生动物细胞生物学研究!B&=-2.$^*[1),4C),4!1/65@9C*@5,摘!要!从PX3损伤角度探讨吲哚%吡啶%喹啉和异喹啉?种工业废水中常见的含氮杂环化合物对模式材料四膜虫的毒性作用)采用单细胞凝胶电泳技术’0cB(和流式细胞术!种快速而灵敏的检测方法联合检测$以四膜虫的彗尾长度%拖尾率%细胞损伤率%PX3损伤专用单位以及PX3相对荧光强度为指标$研究以上?种含氮杂环化合物引起四膜虫核PX3损伤而表现的毒性作用)单细胞凝胶电泳检测表明*四膜虫经?种含氮杂环化合物在不同质量浓度’D和D=4+K(条件下染毒后彗尾长度%PX3损伤专用单位与阴性对照组比较$有显著差异’9)J$()吲哚处理组与吡啶处理组同浓度比较$9’JD$差异不显著&与喹啉%异喹啉处理组同浓度比较$9)J$$差异显著)吡啶处理组与喹啉%异喹啉处理组相同质量浓度比较$9)J$$差异显著)喹啉处理组与异喹啉处理组低质量浓度比较差异不显著$高质量浓度比较则差异显著)流式细胞实验表明*!种质量浓度处理组PX3相对荧光强度低的细胞数比对照组明显增加$?种含氮杂环化合物均表现出较强毒性$毒性大小由强到弱依次为异喹啉%喹啉%吲哚%吡啶)关键词!含氮杂环化合物&毒性&四膜虫&PX3损伤&单细胞凝胶电泳&流式细胞术中图分类号!l$A$@D!!!文章编号!$A&?%%%!##%&DA&’!!!文献标志码!3K%3+/2*%2?),)%/21*)%&2(*23$-%&2,/,.),,20523*+%2!#$%&’()%#&$(*+&,-%LI6-2*(+2*(P!K7BV2*(-3’Q!9G!9S)*(P!8RV3)$2*(P;I*+(/(4#X@%).B-.(’c’+?%,7)16(//4!c’+LK;!67+-%%LIH,7((/(’$+’H,+-,!8-+9)1+.#(’H,+-,%-A?,7-(/(4#(’67+-%!c’+LK;!67+-%#84$%&’,%!\%-%/#1A1#1.B%.+,%//#.7.(N+,+.#(’’(5)-+.)(4-(517.)(,#,/+,,(B@(5-A1,(BB(-/#(,,5))+-4+-S%1.S%.)!+-A(/!@#)+A+-!Y5+-(/+-%-A+1(EY5+-(/+-.(.7?.)%7#B-%+-.7.)%+//-4.7!.%+/+-4)%.!,//A%B%4)%.!XD3A%B%45-+.1%-AXD3’/5()1,-,+-.-1+.#S+.7H6[V1+-4/,//4//,.)(@7()1+1#%-A_6’/(S,#.(B.)##F?7)15/.1+-.7H6[V17(SA.7%..7)S%1%1+4-+’+,%-.0)I;#A+’’)-,1+-.)%+//-4.7%-AXD3A%B%45-+.&.S-.7,(-E.)(/%-A.)%.B-.4)(5@1%.9%)+(51,(-,-.)%.+(-1P!PB4*$#(’.7’(5)-+.)(4-(517.)(,#,/+,,(B@(5-A1F3..71%B,(-,-.)%.+(-/9/!.7)S)-(1+4-+’+,%-.A+’’)-,1+-.(N+,+.#&.S-%-+-A(/.)%.B-.4)(5@%-A%@#)+A+-.)%.B-.4)(5@0’IP#%7(S9)!.7+-A(/%-A@#)+A+-.)%.B-.4)(5@1S)1+4-+’+,%-./#0)I;#A+’’)-.’)(B.7Y5+-(E/+-%-A+1(EY5+-(/+-.)%.B-.4)(5@1+-.)B1(’.(N+,+.#F3.%7+47,(-,-.)%.+(-!.7)S)%1+4-+’+,%-.0)I;#A+’’)E-,1+-.(N+,+.#&.S-.7Y5+-(/+-.)%.B-.4)(5@%-A.7+1(EY5+-(/+-.)%.B-.4)(5@F?7)15/.1+-.7_617(SA.7%..7,//-5B&)S+.7/(SXD3’/5()1,-,+-.-1+.#S%14)%./#+-,)%1A+-.)%.B-.4)(5@1,(B@%)AS+.7.7%.(’.7,(-.)(/(-F3//.7’(5)-+.)(4-(517.)(,#,/+,,(B@(5-A1S)7+47/#.(N+,!%-A.7A1,-A+-4()A)(’.(N+,+.#S%1+1(EY5+-(/+-!Y5+-(/+-!+-A(/%-A@#)+A+-F=/#2&+$!-+.)(4-(517.)(,#,/+,%,(B@(5-A%.(N+,+.#%?.)%7#B-%.7)B(@7+/%%XD3A%B%4%1+-4/,//4//,.)(@7()1+1%’/(S,#.(B.)#中国农业大学学报!#年第$%卷!!!含氮杂环化合物广泛存在于石油工业’食品工业’农药’药厂等工业废水及木材防腐处理场地周围的土壤和地下水中($)&工业废水处理中常见的含氮杂环化合物主要有吲哚’吡啶’喹啉’异喹啉’吡咯及其衍生物等&含氮杂环化合物在自然环境中不易被生物降解!可以长期稳定地存在于土体和水体中(!&%)!对环境和人体健康产生潜在的危害(?)&近年来!从杂环化合物群中不断开发出新的农药!其中约’DM为含氮杂环化合物(D)!对其进行毒性检测已成为评价水环境质量’筛选药物和保护人类健康的重要环节&国内外对含氮杂环化合物毒性的研究主要集中在对大鼠等陆生生物的毒性上!并提出了其中多种化合物对大鼠等的半数致死剂量KPD#以及三致作用情况等!例如吡啶’吲哚’喹啉及!&甲基喹啉对大鼠的经口半数致死剂量分别为#$’$’?’和$!%=4*O4%这?种含氮杂环化合物对水生生物的毒性研究也仅限于淡水纤毛虫!其半数抑制浓度依次为$DJ?’J’$A’JAA和J%%=).*K(’)&水质生物毒性检测方法显示!$%种取代氮杂环类化合物对大型蚤的急性毒性(A)%吡啶’吲哚’喹啉’异喹啉’!&甲基喹啉和#&甲基喹啉’种含氮杂环化合物对小球藻’大型蚤’斑马鱼和发光细菌都具有显著急性毒性&随着化合物浓度的提高!水生生物的存活率’相对生长速度或相对发光度均随之下降&化学物质对不同生物的毒性差异显著!如喹啉对小球藻的?#1半数效应浓度半数效应浓度B0D#为$!J%%=4*K!对发光细菌的B0D为!?J%=4*K!但对大型蚤和斑马鱼的?#与’1半数致死浓度K0D#则分别为$!JAA和%#J??=4*K&对小球藻的毒性大小由强至弱依次为$#&羟基喹啉’吡啶’吲哚’!&甲基喹啉’异喹啉’喹啉%对大型蚤的急性毒性依次为吲哚’#&羟基喹啉’喹啉’异喹啉’!&甲基喹啉’吡啶%对斑马鱼的毒性依次为#&羟基喹啉’!&甲基喹啉’吲哚’异喹啉’喹啉’吡啶%#&羟基喹啉表现出较强的毒性(#)&蚕豆根尖微核试验中!%!’&二氯&哒嗪等$种含氮杂环化合物诱发As微核率的最低质量浓度为J?D=4*K!最高约为#AJ’=4*K()&吲哚’吡啶’喹啉’异喹啉为常见的?种含氮杂环化合物!对其毒性仍然是从常规急性毒性实验了解!没有在细胞水平上直接分析其损伤PX3的情况的研究报道!如鱼类毒性实验采用!?’?#和’1有毒物质的半数致死的质量浓度来表征急性毒性作用的程度%蚤类毒性实验采用水蚤的死亡率或繁殖能力作为测试指标%藻类毒性实验常用藻类的生长抑制效应作为测试指标%发光细菌法通过测定细菌发光强度变化检测急性毒性($&$%)%这些实验的周期为!?#’1!且需要大量实验材料&如果采用单细胞真核生物材料!不仅个体差异小!而且取材方便!大大降低实验工作量&真核单细胞原生动物四膜虫是毒理学研究的重要模式生物!($?)!目前已作为标准检测生物被广泛应用于毒性检测’细胞凋亡和水质检测中($DL$’)&尚未有报道用四膜虫从原发性PX3损伤’染色体畸变等角度对常见的吲哚’吡啶’喹啉’异喹啉?种含氮杂环化合物的遗传毒性的研究&单细胞凝胶电泳0cB#又称彗星实验5)=&96-::-;#!通过检测核PX3断片的析出量彗尾长度’拖尾率#显示核PX3损伤程度和细胞受损伤程度%是快速’灵敏的检测单个细胞PX3损伤的技术!广泛用于遗传毒理学’PX3损伤与修复的检测’细胞凋亡机制’复合环境污染($A)&通过统计细胞损伤率等分析判断被测物的毒性%比3=9:实验’微核实验等更为灵敏和简便&流式细胞术是利用荧光技术检测PX3小片段能够快速高效检测单细胞的表型’胞内蛋白’细胞增殖和凋亡等!还可以定量检测PX3含量!在细胞生物学等研究中广泛应用($#)&以上!种技术都适合单细胞材料!利用PX3荧光快速检测PX3损伤&根据遗传毒性联合检测原则!选用这!种技术可提高实验结果准确性&本研究旨在提高针对性和快速检测!通过模式单细胞材料四膜虫的原发性PX3损伤角度探讨常见的?种含氮杂环化合物的毒性作用&!!材料与方法!*!!仪器与主要试剂E9=-$’型离心沉淀机珠海黑马医学仪器有限公司#%PYY&’0型电泳仪北京六一仪器厂#%PY0T&%$P型电泳槽北京六一仪器厂#%Wl&?$型荧光显微镜UKYVT7#%流式细胞仪WB0e&V3X0U7K‘BSBT\0lK#&低熔点琼脂糖KV3!T+)=94-公司产品#!十二烷基肌氨酸钠3=+9:5)公司产品#!‘+26),l&$3=+9:5)公司产品#!吲哚’吡啶’喹啉和异喹啉及其他试剂均#D!第%期徐忠东等$含氮杂环化合物对四膜虫的毒性作用研究为分析纯&!*!实验材料嗜热四膜虫;.2$A4%$.24’(,#$#!由中国科学院水生生物研究所赠送&!*%!实验方法!*%*!!四膜虫的培养!将四膜虫接种于培养液蛋白胨$D4!酵母粉D4!葡萄糖$4!双蒸水$=K!GEA!分装!高压灭菌&#中!%m条件下培养A!1&!*%*!含氮杂环化合物对四膜虫毒性实验!取四膜虫培养液$=K分装于支$JD=K的离心管中!在%!+*=2,的条件下离心!=2,!弃去上清液!将沉淀重悬浮为原培养液体积的$*$&其中#支依次加入吲哚’吡啶’喹啉和异喹啉溶液!终质量浓度分别为D和D=4*K!在常温下染毒JD’$和!1!同时加TW设为阴性对照组&根据预试!参考单细胞真核生物小球藻急性毒性试验的试剂浓度!每种含氮杂环化合物只设计D和D=4*K!种质量浓度!重复%次&!*%*%!含氮杂环化合物的毒性测定$#单细胞凝胶电泳分析&染毒%=2,后进行彗星实验!每种处理制备%片凝胶&在完全磨砂的载玻片上铺第一层$D’K质量分数为$M的正常熔点的琼脂糖XV3#!?m!$=2,%铺第二层#’K质量分数为J#M的低熔点琼脂糖KV3#和细胞悬液的混合液!?m!$=2,%铺第三层质量分数为JDM的低熔点琼脂糖A’K!?m!$=2,&将制备的凝胶放入冷的裂解液!JD=).*KX-0.!$==).*KX-!BP‘3!$==).*K‘+2:!$=4*=K十二烷基肌氨酸钠!$M体积分数#‘+26),l&$!$M体积分数#PVUGE$#中!?m下裂解!1&然后放入蒸馏水中漂洗$=2,!以洗去凝胶表面的盐分!再放入电泳槽中&将新鲜配置的电泳缓冲液$==).*KX-!BP‘3!%==).*KX-UE!GE$%#倒入电泳槽!约覆盖过载玻片J!D5=!盖上盖子!?m!静置!=2,使双链PX3解螺旋&调节电泳液液面高度!于$D]!$#=3下电泳!=2,&电泳完毕!取出载玻片浸入J?=).*K‘+2:缓冲液GEAJD#!中和%=2,&用BW!=4*K#染色$D=2,!双蒸水洗掉表面的染料!!?1内在荧光显微镜下观察’拍照记录!每片计数D个细胞&!