华理微生物实验

实验一普通光学显微镜的使用一．实验目的1.了解普通光学显微镜的结构、基本原理、维护和保养方法；2.掌握普通光学显微镜的正确使用方法。二．实验原理1.普通光学显微镜的结构普通光学显微镜由机械装置和光学系统组成。图.普通光学显微镜的结构示意图1.目镜；2.镜筒；3.物镜转换器；4.物镜；5.镜台；6.聚光器；7.可变光阑；8.反光镜；9.镜座；10.粗调节螺旋；11.细调节螺旋；12.镜臂。（1）机械装置（图）镜座上显微镜的基座，起稳定和支持整个机身的作用，使显微镜能平稳放置在平面上，有的显微镜在镜座内装有照明光源等。镜柱是连接镜座和镜臂的短柱。镜臂用以支持镜筒，也是移动显微镜时用手握住的部分。直筒显微镜的镜座和镜臂之间有一倾斜关节，可以使镜臂倾斜一定的角度，便于观察。但倾斜度一般不超过45°，避免显微镜失去重心而翻倒。镜筒倾斜式显微镜无此关节。镜筒是连接目镜与物镜的金属筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光学显微镜可以分为单筒式和双筒式两类。单筒式又分为直筒式和倾斜式两种；双筒式均为倾斜式。镜台又被称为载物台，在镜筒下方，是放置标本的地方，为方形或圆形。镜台中央有一圆形通光孔，两侧各有一个用于固定被检标本片的压片夹。有的显微镜则有标本移动器，移动器上装有弹簧夹，可固定标本片。转动螺旋可以使标本片前后和左右移动。有的标本移动器上还带有游标尺，可指明标本所在的位置。物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜，使用时可通过转动物镜转换器选用合适的物镜。为使用方便，物镜应按从低倍到高倍的顺序安装。转换物镜时，必须用手按住圆盘旋转，切勿用手指直接推动物镜，以免使物镜和转换器间的螺旋松脱而损坏显微镜。调节器安装在镜臂基部或镜柱两侧的粗、细螺旋上，可调节物镜与被检标本片之间的距离，以便清晰地观察标本。粗调螺旋旋转一周可使镜筒升降约10mm，一般用于低倍镜调焦；细调螺旋旋转一周可使镜筒升降约0.1mm的距离，用于高倍镜、油镜或分辨物像清晰度的调焦。（2）光学部分物镜安装在物镜转换器上，是显微镜中很重要的光学部件，是由多块透镜组成的一个镜头组。根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，物镜可以被分为低倍镜、高倍镜和油镜三类。低倍镜的放大倍数常为4、10、20；高倍镜的放大倍数常为40、45；油镜的放大倍数常为90、95、100，油镜镜筒上刻有OI或HI或oil字样，也有刻一圈红线或黑线为标记的，借以区别于其他物镜。物镜上标出了物镜的重要参数，包括放大倍数、数值孔径（NA）、物镜镜筒高度（单位是mm）及要求盖玻片的厚度等。现举例说明其含义如下（图）：图.显微镜物镜上的重要参数及大致的工作距离目镜呈短圆筒状，装在显微镜上端。目镜的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜由两片透镜组成，上面一块为接目透镜，下面一块为聚透镜，在两块透镜之间或聚透镜的下方有一视野光阑。在进行显微镜测量时目镜测微尺要放在视野光阑上。目镜上刻有放大倍数，如5、10、15、20等，可以根据需要选择合适的目镜。聚光镜又称聚光器，安装在镜台下，由多块透镜组成，其作用是把平行的光线聚焦到标本上，增强亮度。一般在镜柱一侧有一旋纽，可使聚光镜升降。聚光镜与物镜配合使用，通常用低倍镜时聚光镜应下降，而当使用油镜时聚光镜应升到最高位置。在聚光镜的上方是虹彩光阑，俗称光圈。光圈由十几张金属游片组成，通过调节光阑孔径的大小，可以调节进入物镜的光线的强弱。在观察较透明的标本时，光圈宜小一些，这时分辨率虽然降低，但反差增强，从而使透明的标本看得更清楚；但不宜将光圈关得太小，以免由于光干涉现象而导致成像模糊。当使用油镜时，把光圈完全打开，增强射入光线的强度。在光圈下常装有滤光片架，可以放置不同颜色的滤光片。在聚光镜下方的镜座上，安装有反光镜。反光镜是一个有平、凹两个面的双面镜，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转，其作用是采集光线并将光线射向聚光镜。凹面镜还能起到聚光的作用。因此，未安装聚光镜的显微镜及光源较弱时可应用凹面镜，而在光源较强及用聚光镜时一般可用平面镜。有的显微镜安装有电光源，使用时不用通过反光镜就可以进行观察。2.普通光学显微镜的光学原理由单透镜构成的放大镜和由几块透镜组成的实体显微镜称单式显微镜。现代普通光学显微镜是利用两组透镜系统来放大成像，故又被称为复式显微镜。其光学原理是：由外界入射的光线经反光镜反射向上，或由内光源发射的光线经聚光镜向上汇聚在被检标本上，由标本反射或折射出的光线经物镜进入，使光轴与水平面倾斜45角的棱镜在目镜的视场光阑处，成放大的侧光实像，该实像再经目镜的接目透镜放大成虚像。（1）显微镜的放大倍数被检标本经显微镜的物镜和目镜放大后的总放大倍数是：标本放大倍数＝物镜的放大倍数目镜的放大倍数。如：用40的物镜和10的目镜，总放大倍数是400。（2）分辨率评价一台显微镜的精密程度，不仅要看其放大倍数，更重要的是看其分辨率。分辨率是指显微镜能够辨别发光的两个点的最小距离的能力，该最小的距离被称为鉴别距离或分辨距离（R）。R的计算公式如下：R＝／（2NA）；其中，代表入射光的波长，NA代表物镜的数值孔径。图：物镜的进口角1.物镜；2.进口角；3.标本面。NA的计算公式如下：NA=nsin。其中，n代表光线进入物镜前所在介质的折射率，代表进口角（图）的半数。的最大值不可能达到90，故sin1。当介质为空气时，n＝1。所以干燥系下物镜的数值孔径都小于1。使用油镜时，物镜与标本片之间的介质是香柏油（n=1.515）或液体石蜡（n=1.52），故而数值孔径增大。因而油镜的分辨率要优于其他物镜。（3）工作距离工作距离是指观察标本最清晰时，物镜透镜的下表面与标本之间（无盖玻片时）或与盖玻片之间的距离。物镜的放大倍数越大，工作距离越短。油镜的工作距离最短，约为0.2mm。不同放大倍数的物镜的工作距离不同，但在同一台显微镜中，不同放大倍数的物镜切换时，只须进行细调焦便可清晰地观察到标本。三．实验器材普通光学显微镜、擦镜纸、无水乙醇、香柏油、微生物标本片（包括枯草芽孢杆菌Bacillussubstilis、大肠埃希氏菌Escherichiacoli、四联球菌Tetraggenococcussp.、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae）四．实验内容（一）观察前的准备1．显微镜的放置置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边缘约3~4cm。2．调节光源接通电源后，取下目镜，直接向镜筒内观察，调节聚光镜上的孔径光阑，使光阑孔径与视野恰好一样大或略小于视野。该步骤的目的是使入射光展开的角度与物镜的数值孔径相一致，既可充分发挥该物镜的分辨率，又能把超过该物镜可能接受的多余光挡住，避免产生干扰。放回目镜后，通过调节聚光镜上的视野光阑或调节照明度控制钮，选择最佳的照明效果。（二）观察一般情况下，特别是初学者，进行显微镜观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序，因为物镜的放大倍数越小，视野相对也越大，越易发现目标及确定检查的位置。1．低倍镜下观察标本（1）放置标本：下降镜台或升高镜筒，将标本片放置在镜台上，用压片夹夹紧，调节标本移动器使标本片上有染色剂的部分处于物镜正下方。（2）调焦：转动粗调节螺旋，升高镜台或下降镜筒，使低倍镜头的前端接近载玻片。用双眼在目镜上观察，并转动粗调节螺旋，使镜台下降或镜筒上升直到可看到物像。然后转动细调节螺旋，使物像清晰。（3）观察：寻找合适的目的菌，仔细观察。2．高倍镜下观察（1）寻找合适的视野：在低倍镜下找到合适的目的菌，通过调节标本移动器使其移至视野中心。（2）转换高倍镜：用手按住物镜转换器慢慢旋转，当听到“咔嚓”一声即表明物镜已转到正确的工作位置上。（3）调焦：一般情况下，通一台显微镜上的物镜是同焦物镜。也就是说，从低倍镜切换到高倍镜后，只要稍微调节一下细调螺旋就可以看清物像。（4）观察：仔细观察标本，比较与低倍镜下的异同。3．油镜下观察（1）寻找合适的视野：在高倍镜下找到合适的目的菌，通过调节标本移动器使其移至视野中心。（2）加香柏油：从小瓶内取香柏油1~2滴，加到欲观察的涂片上。（3）转换油镜：将油镜转到工作位置，下降镜筒，使油镜浸入香柏油中，并从侧面观察，使镜头降至既非常接近标本片，又不能与标本片相接触的合适位置。（4）调节亮度：调节聚光器到最高位置，打开光圈到最大位置，使进入油镜的光线最多。（5）调焦：从目镜中观察，同时转动粗螺旋，缓慢拉开油镜和标本片的距离，至出现模糊的物像时再用细调螺旋调节至物像清晰为止。若按上述操作找不到物像，有可能使开始时油镜头下降未到位，也有可能是油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。（6）观察：仔细观察标本，比较与低、高倍镜下的异同，并细心绘制形态图。（三）观察后对显微镜和标本片的处理1．处理显微镜（1）转动粗调节螺旋，使镜筒和镜台的距离拉开，取出标本片。（2）清洁油镜：先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用蘸少许无水乙醇的擦镜纸擦掉残留的香柏油，再用干净的擦镜纸擦去残留的无水乙醇。若使用液体石蜡作镜油，可以只用擦镜纸擦净，不必使用无水乙醇。（3）清洁目镜和其它物镜：用擦镜纸擦净其它的物镜及目镜。（4）清洁后应将物镜转成“八字形”，缓慢上升镜台，使物镜搁置在镜台上。将聚光镜降至最低位置。在显微镜上套上镜罩后放入显微镜柜中。2．处理标本片：对标本片上的香柏油，要用拉纸法擦试。先把一张小擦镜纸盖在油滴上，再滴上2~3滴无水乙醇，平拉擦镜纸，使其轻轻在标本片上拖过。重新换上干净擦镜纸后重复。2~3次后，肉眼观察标本片上无香柏油残留即可。五．注意事项1．取显微镜时应该用右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜身保持直立。切忌单手拎提显微镜。2.所有镜面切忌用手指、纱布、普通纸张擦试，以免磨损镜面，需要时只能用擦镜纸擦试。3.粗、细调节螺旋调焦时，切忌采用对着目镜边观察边上升镜台的错误操作，应从侧面注视，以免压坏标本片和损坏镜头。油镜的工作距离很短，操作时要尤其小心谨慎。4.观察标本片时注意标本片的正面，也就是涂布有微生物的一面向上。5.观察完毕后注意用正确的方法擦试标本片上的残余香柏油。动作要轻柔，切勿将标本片上涂有微生物的部分擦去。六．实验记录绘制四个形态图，分别记录油镜下观察到的枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、四联球菌、酿酒酵母的个体形态。七．预习思考题列出显微镜的低倍镜、高倍镜和油镜的观察对象。八．思考题1.使用油镜观察时为何要在标本片和镜头之间滴加香柏油？2.使用油镜观察时应如何调节显微镜的聚光镜和光圈？3.如果放置标本片时不小心放反，使标本片正面在下，用低倍镜和高倍镜都可以正常观察，但用油镜却找不到观察对象，为什么？4.油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过多的酒精擦试会有什么危害？实验二微生物的形态观察一．实验目的1.通过观察认识细菌的基本形态、细菌的特殊结构和群体形态。2.通过观察认识放线菌的基本形态、孢子丝的形态和群体形态。3.通过观察认识真菌的基本形态、特化结构和群体形态。4.巩固光学显微镜的使用方法，重点掌握油镜的使用方法。5.学习微生物个体形态图画法。二．实验原理微生物种类繁多，不同的微生物其个体形态和群体形态是不同的。因此微生物的形态是其分类鉴定的依据之一。最常见的细菌个体形态分为三类，分别为球菌、杆菌和螺旋菌，放线菌和霉菌的个体形态都为丝状菌，酵母菌的个体形态为卵圆形。放线菌根据其孢子丝的不同分为螺旋和直型等，根据分化的情况分为丛生和轮生等。霉菌的特化型菌丝有青霉菌的青霉穗，曲霉的足细胞和根霉的假根等。一个细胞在固体培养基上繁殖集聚成肉眼可见的集落称为菌落。各种微生物在一定培养条件下形成的菌落具有一定的特征，包括菌落的大小、形状、光泽、颜色、气味、与培养基结合的牢固度等。一般而言细菌的菌落较小，表面光滑或粗糙，湿润或干燥，具有臭味，与培养基结合不牢固（易被挑起）。放线菌的菌落大小与细菌菌落大小相似，表面大多呈干燥粉状，具有土腥味，与培养基结合牢固（不易被挑起）。有些放线菌的基内菌